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实验六纸层析法观察转氨基作用

【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用

09 救援一班第三大组李岚宇2009222336

室温：28°

（一）实验目的：

1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）实验原理：

转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α- 酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基

酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移

到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT ）催化如下反应：

ALT

α—酮戊二酸+ 丙氨酸谷氨酸+ 丙酮酸

本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，

以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸

的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断

分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组

分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不

同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf 表示：

物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf 也相对稳定，因此在同一层析体系中

可用Rf 值来鉴定被分离的物质。

（三）实验材料与仪器：

试剂：

1、0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液。

2、0.2mol/L Na 2HPO4 溶液81ml 与0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液19ml 混匀,用蒸馏水稀释

20 倍。

3、0.1mol/L 丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891 克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓

冲液中,以1.0 N NaOH 仔细调至pH7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。

4 、0.1mol/L －α酮戊二酸称取α－酮戊二酸 1.461 克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中，以 1.0 N NaOH 仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。

5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735 克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓

冲液中，以 1.0 N NaOH 仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。

6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5 克于100 ml 丙酮中溶解。

7、层析溶剂：将重蒸过的酚 2 份和水 1 份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，

静置24 小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

仪器：玻璃匀浆器、10ml 试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm 圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

（四）实验步骤:

1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5 克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓冲液 1.0 ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液 4.5ml 混匀备用。

2、酶促反应过程

（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸

水浴中加热10 分钟，取出冷却。

（2）各加0.1mol/L 丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/L -酮α戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液1.5 ml, 摇匀。

（3）37℃保温，30 分钟后取出，保温完毕。

（4）把测定管放沸水浴中煮10 分钟，取出后冷却，过滤。

3、层析

（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约 1 cm 为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。

（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4 处。把测定液、对照液分别点在原点1、3 处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm 以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第 2 次。

（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。

（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿

纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm 时，约25 分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。

（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。

（五）实验结果记录：

图（1）

点样溶液色斑个数溶质中心到原点中心的溶质前缘到原点中心Rf 值

距离的距离

测定管上清液 2 未知溶质 a 1.50cm 2.50cm 0.6

未知溶质 b 0.40cm 2.50cm 0.16 丙氨酸 1 1.30cm 2.20cm 0.6

对照管上清液 1 1.50cm 2.50cm 0.6 谷氨酸 1 0.40cm 2.20cm 0.16

表格（1）

（六）实验讨论：

1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf 值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质 b 为谷氨酸，则未知溶质 a 为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。

2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。

3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。

4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.

2010 年9 月19 日