2 液相色谱流动相和固定相的选择课件

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流动相的准备—除气
CONFIDENTIAL
气泡的形成
• 空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂
• 多余的气体将离开溶剂形成气泡
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流动相的准备—过滤
CONFIDENTIAL
需将流动相中的颗粒除去
• 细小颗粒会阻塞色谱柱 • 影响泵的使用 • 影响检测器流通池
储液瓶加盖 溶剂进口加过滤头 加预柱保护色谱柱
• 找出适用的波长范围
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溶剂的化学性质— 溶剂强度
CONFIDENTIAL
溶剂强度 (strength)
• 强流动相会造成较少的静态滞留，得到较短的分析时 间
• 非极性或有机溶剂对反相色谱是较强的溶剂
• 极性溶剂对正相色谱是较强的溶剂
弱
正相
己烷 1-氯丁烷 二氯甲烷 乙腈
反相
水 二甲基亚砜 DMSO 甲醇 乙腈 四氢呋喃
CONFIDENTIAL
液相色谱流动相 和固定相选择
CONFIDENTIAL
3、液相色谱流动相的选择
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流动相导论
CONFIDENTIAL
溶剂系统 • 可以是一种或多种水溶液或有机溶剂 • 携带样品流经色谱柱至检测器 • 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离 选择溶剂需考虑的问题 • 极性与溶剂强度 • 纯度、过滤、除气 • 与其他溶剂的互溶性 • 缓冲溶液与pH • 等梯度或梯度洗脱分析
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正相色谱流动相
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使用非极性溶剂作主要的流动相组成 (A)
• 以一种或多种极性较强的溶剂作修饰剂 (B)
• 单元成分通常是碳氢化物再加入以下成分 – 10- 50% chlorinated hydrocarbon
– 1-5% alcohol
极性相互作用造成分离 • 流动相和固定相竞争溶质
CONFIDENTIAL
Immiscible Miscible
Diisopropyl ether
Tetrachloroethane Tetrahydrofuran Toluene Trichloroethane Xylene
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溶剂的化学性质—压缩性、折光性
CONFIDENTIAL
压缩性
• 瓦里安液相泵可以自动调节不同溶剂混合时的压缩比
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反相色谱使用的溶剂
CONFIDENTIAL
多用水作主要的流动相组成
(A)
• 水极性强、有低的蒸汽压 • 除极性或离子型溶质外所有疏水性物质均会附着在固定 相上造成保留 • 必须使用色谱级纯水，避免系统污染
调整有机溶剂（作修饰剂） (B) 的浓度
• 是改变组分保留的主要因素 • 有三种反相色谱常用的有机溶剂 –Acetonitrile, Methanol, THF
折光指数 (RI)
• 一般溶剂RI值为：1.30-1.40
• 高分子或含卤素溶剂，RI值为 1.35-1.50 • 芳香族溶剂RI 值为：1.50-1.55 • 检测质量与溶质和溶剂的折光指数差有关
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溶剂的化学性质— UV吸收
CONFIDENTIAL
UV cutoff（截至波长）
• 溶剂在某一波长下经 1cm 光程其吸收值大于 1、 则该波长以下的区域称为 UV cutoff
UV cutoff （nm） 210 220 210
抗氧化剂
• 保护样品和仪器硬件
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选择正确的流动相
CONFIDENTIAL
合适的流动相
• 改善分离效果
要求
• • • • • • • 性质稳定，对色谱柱无影响 与检测器匹配 对样品有很好的溶解性 低黏度、低沸点 纯度高 易得到，价格适中 尽量避免使用有毒溶剂
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强
溶剂的化学性质— 溶剂强度（续）
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溶剂强度 • 示例：反相色谱 –随有机溶剂比例增加，分离速度也增加 –高百分比的有机溶剂强度较大
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流动相的准备
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配置流动相 • 混合、除气、过滤 溶剂的混合 • 每一组成的溶剂在混合前必须分开测量体积再混合 • 两种溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和
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溶剂的化学性质—混合性、黏度
CONFIDENTIAL
混合性 • 混合性不佳，会产生气泡 • 可先做混合实验，确认互 溶性 黏度 • 高黏度溶剂产生高柱压， 降低柱效 • 溶剂混合时黏度呈非线性 变化 –注意溶剂梯度混合时最 大黏度产生时的压力
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溶剂互溶表
Acetic acid Acetone Acetonitrile Benzene Butanol Carbon Tetrachloride Chloroform Cyclohexane Cyclopentane Dichloroethane Dichloromethane Dimethylformamide (DMF) Dimethylsulfoxide (DMSO) Dioxan Water Ethanol Ethyl acetate Diethyl ether n-Heptane n-Hexane Methanol Methyl ethyl ketone Iso-Octane n-Pentane 2-Propanol
ຫໍສະໝຸດ Baidu
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流动相的准备—添加剂
CONFIDENTIAL
缓冲溶剂 • 维持溶液的 pH
– 维持生物活性或酸碱交互 作用
pH range 2-3.5 3.6-6 6-8
Buffer Phosphate Acetate phosphate
• pH>7 可能会造成填料溶 解
• 至少添加 50-100 mM • 需避免加入缓冲剂后发 生沉淀造成系统损伤
• 流动相能吸附在固定相上， 造成溶质在固定相上吸附力 的减弱
• 痕量的水足以改变吸附表面活性 • 控制水含量是得到较好重现性的主要因素
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离子交换溶剂
CONFIDENTIAL
使用缓冲溶液在一 pH 值下让样品带电 • 酸性样品：pH 必須大于 5 • 碱性樣品：pH 必須小于 5 当缓冲溶液浓度增加、溶剂强度变强， 减少保留 加入有机溶剂能改变保留特性与选择性 离子对试剂通常微短链离子
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等度洗脱
CONFIDENTIAL
等度洗脱不能完全分离样品 • 某些样品太复杂 • 较早洗脱出的色谱峰分离度太差 • 较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾 • 考虑梯度洗脱
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梯度洗脱
CONFIDENTIAL
梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强 • 梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚合物样 品的分离