烟草遗传转化体系的建立

本科生毕业设计（论文）

（ 2015届）

农业与食品科学学院

题目：烟草遗传转化体系的建立

学号：

姓名：

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2015 年 5 月18 日

本科生毕业设计（论文）诚信承诺书

我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）《烟草遗传转化体系的建立》均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。

承诺人（签名）：

年月日

目录

本科生毕业设计（论文）.............................................................................................. 封1 本科生毕业设计（论文）诚信承诺书...................................................................................... 封2 1 前言. (1)

1.1 农杆菌介导法 (1)

1.2 基因枪法 (2)

1.3 PEG法 (2)

1.4 显微注射法 (2)

2 材料与方法 (3)

2.1 试验材料 (3)

2.1.1 植物材料 (3)

2.1.2 菌株和质粒 (3)

2.2 试验方法 (3)

2.2.1 农杆菌的制备 (3)

2.2.2 叶片表面消毒 (3)

2.2.3 预培养-侵染-共培养 (4)

2.2.4 特美汀对农杆菌的抑制作用 (4)

2.2.5 芽分化-卡那霉素浓度的测定 (4)

2.2.6 根分化 (5)

2.2.7 炼苗-移栽 (5)

2.2.8 转基因植株的分子鉴定 (5)

3 结果与分析 (6)

3.1 农杆菌菌液侵染时间对转化效率的影响 (6)

3.2 共培养时间对转化率的影响 (7)

3.3 特美汀对根瘤农杆菌的抑菌效果 (7)

3.4 卡那霉素浓度对烟草叶片外植体出愈率的影响 (8)

3.5 转基因植株的分子鉴定 (8)

4 讨论 (9)

参考文献 (9)

致谢 (11)

烟草遗传转化体系的建立

农业与食品科学学院农学111 吴春盛指导教师：郑志富摘要：利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物,这是研究目的基因功能的一种有效方法。本研究将通过探索农杆菌的浸染时间、共培养时间、不同度浓度的特美汀抗生素抑制农杆菌的效果以及不同浓度的卡那霉素（Kan）影响抗性芽分化等因素对烟草K326叶盘转化率的影响,建立一种稳定、高效的烟草K326遗传转化体系。

关键词：烟草；组织培养；农杆菌；遗传转化

Eestablishment of a Tobacco Genetic Transformation

System

Abstract: Using agrobacterium-mediated transformation to genarate transgenic plants is an effective way to study gene function. This study was aimed to investigate the factors influencing the efficiency of tobacco leaf disc-based transformation, including the infection time of Agrobacterium, co-cultivation time with Agrobacterium, various concentrations of timentin with inhibitory effects on Agrobacterium growth, and different concentrations of Kanamycin (Kan) affecting differentiation rates of the resistant buds in attempt to establish a robust and efficient genetic transformation system of Nicotiana tabacum L. cv K326.

Key words: Nicotiana tabacum, Tissue culture, Agrobacterium, Genetic transformation

1前言

所谓遗传转化，是指通过自然或人工感受态细胞的摄取，将同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA分子)转入受体细胞或组织中，并在后代中表达基因特性的基因转移过程。根据感受态细胞的构建方式，遗传转化可以分为自然遗传转化和人工转化两种，其中，自然遗传转化的感受态细胞的出现是细胞本身在一定生长阶段的生理特性，而人工转化则是在人为诱导的基础上，细胞的结构发生一定的变化而具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA分子直接注入细胞内[4]。常用的遗传转化方法有如下几种：

1.1 农杆菌介导法

根瘤农杆菌介导的遗传转化方法获得了第一批能表达外源基因功能的转基因植物。用根瘤农杆菌转化体系获得的转基因植株占到了已转化成功的近200种转基因植株的80%以上[4]。这种方法具有操作简单、转基因拷贝数低、转化率高、操作成本低等优点[5]，已受到人们的高度重视，并成为植物转基因研究的主要方法之一。

农杆菌属于革兰氏阴性菌种，在基因操作中，常用的两类菌种是根瘤农杆菌（含致瘤Ti质粒）和发根农杆菌（含致根Ri质粒）[6]。目前，在遗传转化中研究得最广泛且最常用的是Ti质粒，当外植体被根瘤农杆菌感染时，根瘤农杆菌环状Ti质粒上的一部分DNA可以整合到被感染植物的基因组中，且其携带的基因能在后代中稳定表达，但农杆菌本身不侵入植物的细胞[12-13]。农杆菌介导的遗传转化法的主要过程为：（1）细菌亲近植物的感受态细