酶活力测定
【免费下载】酶活力的测定 国标
（mL）
0
1
2
3
4
5
（mL）
10
9
8
7
6
5
然后按以下流程操作：
试管A（空白）
↓ 加酶液2.00mL
↓（40±0.2）℃，2min 加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
↓（40±0.2）℃，10min
加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀） 加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
↓ 取出静止10min，过滤
（慢速定性滤纸）
100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。 3. 氢氧化钠溶液（20g/L）
称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。待溶液到室温后 ，以水定容 至100mL，搅拌均匀。 4. 盐酸溶液
1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。 0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。 5. 酪蛋白溶液（10.0g/L） 称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲 溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。冷却到室温后转入 100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内 贮存，有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值。
式（1）中：
X1—由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，u/mL；
X2—样品的酶活力，u/g；
V—溶解样品所使用量瓶的体积，mL；
n—稀释倍数；
8—反应试剂的总体积，mL；
2—吸取酶液的体积，mL；
m—样品的质量，g；
1/10—反应时间 10min，以 1min 计。
1、标线的绘制
管号 酪氨酸的浓度
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，系电，力根通保据过护生管高产线中工敷资艺设料高技试中术卷资，配料不置试仅技卷可术要以是求解指，决机对吊组电顶在气层进设配行备置继进不电行规保空范护载高与中带资负料荷试下卷高问总中题体资，配料而置试且时卷可，调保需控障要试各在验类最；管大对路限设习度备题内进到来行位确调。保整在机使管组其路高在敷中正设资常过料工程试况中卷下，安与要全过加，度强并工看且作护尽下关可都于能可管地以路缩正高小常中故工资障作料高；试中对卷资于连料继接试电管卷保口破护处坏进理范行高围整中，核资或对料者定试对值卷某，弯些审扁异核度常与固高校定中对盒资图位料纸置试，.卷保编工护写况层复进防杂行腐设自跨备动接与处地装理线置，弯高尤曲中其半资要径料避标试免高卷错等调误，试高要方中求案资技，料术编试交写5、卷底重电保。要气护管设设装线备备置敷4高、调动设中电试作技资气高，术料课中并3中试、件资且包卷管中料拒含试路调试绝线验敷试卷动槽方设技作、案技术，管以术来架及避等系免多统不项启必方动要式方高，案中为；资解对料决整试高套卷中启突语动然文过停电程机气中。课高因件中此中资，管料电壁试力薄卷高、电中接气资口设料不备试严进卷等行保问调护题试装，工置合作调理并试利且技用进术管行，线过要敷关求设运电技行力术高保。中护线资装缆料置敷试做设卷到原技准则术确：指灵在导活分。。线对对盒于于处调差，试动当过保不程护同中装电高置压中高回资中路料资交试料叉卷试时技卷，术调应问试采题技用，术金作是属为指隔调发板试电进人机行员一隔，变开需压处要器理在组；事在同前发一掌生线握内槽图部内 纸故，资障强料时电、，回设需路备要须制进同造行时厂外切家部断出电习具源题高高电中中源资资，料料线试试缆卷卷敷试切设验除完报从毕告而，与采要相用进关高行技中检术资查资料和料试检，卷测并主处且要理了保。解护现装场置设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法
酶活性的测定方法有多种。
以下列举了常见的几种方法：
1. 酶动力学法：通过测定酶催化底物转化为产物的速率，来确定酶活性。
常用的酶动力学方法有初始速率法、双重倒数法、利用酶反应速率与底物浓度的关系等。
2. 比色法：利用酶与底物反应后产生的色素变化进行酶活性测定。
例如，过氧化物酶活性可通过测量其催化产生的有色产物浓度的变化来确定。
3. 荧光法：利用酶与底物反应后产生的荧光变化进行酶活性测定。
荧光法的灵敏度高，操作简便。
例如，酯酶活性可通过测量底物转化为产物后产生的荧光强度的变化来确定。
4. 放射性同位素法：将放射性同位素标记在底物上，通过测量酶催化底物与同位素的结合来确定酶活性。
例如，放射性同位素法可用于测定DNA聚合酶活性。
5. 电化学法：利用酶与底物反应后产生的电流变化进行酶活性测定。
常用的电化学方法包括循环伏安法和电化学阻抗法。
例如，葡萄糖氧化酶活性可通过测量产生的电流与葡萄糖浓度之间的关系来确定。
值得注意的是，不同酶具有不同的理化性质和催化机制，因此需要根据具体酶的
特性选择适合的测定方法。
酶活力测定讲解
2019/5/10
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２.试剂 ? Folin- 酚试剂见“蛋白质含量测定”。 ? 0.4mol/L 碳酸钠溶液。 ? 0.4mol/L 三氯乙酸溶液。 ? 缓冲溶液
①PH7.5 磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。 ②pH3.0 乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。 ③pH10.5 硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。
取两个100ml三角瓶分别于空白瓶和样品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸缓冲液5ml于空白瓶加入95乙醇15ml40水浴预热5min然后在两瓶中各加待测酶液1ml立即混匀计时40水浴中准确反应15min在样品瓶中立即补加95乙醇15ml终止反应取出于空白瓶和样品瓶中各加酚酞指示液005mollnaoh标准溶液滴定直至微红并保持30s不退为其终点记录消耗005mollnaoh标准溶液的体积201951035计算酶活力定义
上述各种缓冲溶液，均须用 pH计校正。
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10g/L 酪蛋白溶液：称取酪蛋白 1.000g ，准确至 0.001g ，用少量 0.5mol/L NaOH 溶液（若酸性 蛋白酶则用浓乳酸 2～3滴）湿润后，加入适量 的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80mL ，在沸水浴 中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀 释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为 3d 。
１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的
糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
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２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。 稀碘液：同“分光光度法”。
20g/L 可溶性淀粉溶液：同“分光光度法”
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的特性和作用机制，掌握测定酶活力的基本方法和原理，并通过实验数据的分析和处理，计算出酶的活力值，为进一步研究酶的性质和应用提供基础数据。
二、实验原理酶是一种具有生物催化活性的蛋白质或核酸分子，能够加速化学反应的进行。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。
本次实验采用的是分光光度法测定酶活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在一定条件下，加入适量的过氧化氢溶液，然后通过测定反应体系中剩余过氧化氢的量，间接计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝组织过氧化氢溶液（3%）磷酸缓冲液（pH 70）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器试管、量筒、烧杯等玻璃仪器四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜猪肝组织_____g，剪碎后放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在 4℃下以_____rpm 离心_____min，取上清液即为酶液。
2、绘制标准曲线取 6 支干净的试管，分别加入 0、01、02、03、04、05 mL 的过氧化氢标准溶液（10 mmol/L），然后用磷酸缓冲液（pH 70）补足至 1 mL。
向各试管中加入 2 mL 显色剂（4-氨基安替比林与酚的混合液），摇匀后在 37℃水浴中保温 15 min。
以第一支试管为空白对照，在分光光度计上于 510 nm 波长处测定各管的吸光度值。
以过氧化氢的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3、酶活力的测定取 2 支干净的试管，分别标记为测定管和对照管。
向测定管中加入 1 mL 酶液和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，在 37℃水浴中反应 5 min。
向对照管中加入 1 mL 磷酸缓冲液（pH 70）和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），在 37℃水浴中保温 5 min。
酶活力测定
1、酶活力测定：样品待测液用0.5MpH6.5磷酸盐缓冲液适当稀释（稀释倍数因酶含量不同而异，可参考下表）。
测定时，取样品稀释液0.5毫升，37℃预热2分钟，加入37℃预热的底物0.5毫升，精确反应15分钟后加入乳化剂2毫升，停止反应。
反应液3000转/分离心10分钟，上清液在721型分光光度计上于540毫微米波长处比色，空白管以缓冲液代替酶，其它操作同上。
附：艳红K-2BP标记溶性微球菌
M.lysodeikticus的制备
1、菌体的培养与收集：取菌种Micrococcus lysodeikticus 634，接种于肉汤培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂：2.5%、pH7.5压力为1 03.4Kpa，灭菌15分钟）。
37℃培养48~72小时后收集菌体，先用蒸馏水后用丙酮反复洗涤，最后用乙醚处理，可得到干燥菌体。
2、艳红K-2BP标记溶性微球菌M.lysodeikticus：取干燥菌体5g，加入50毫升1.25mol/LNaOH，再加2.5克活性染料艳红K-2BP（上海染化入厂生产）搅拌均匀，于25℃水浴放置24小时进行染色后，3000r/min离心10分钟收集红色菌体。
染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心，以尽量除去末参加反应的游离染料，必要时再用强碱性711树脂在搅拌下进行处理（树脂处理成Cl—型，pH7，树脂的湿重量约为染色菌体的50倍），除去未能洗尽的游离染料，反复处理直到上清液无色。
由此得到净化的染色菌体，直接悬于0.5mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%底物溶液。
或者将
染色菌体冻干或制成丙酮粉，使用时再磷酸盐缓冲液配制。
5酶类药物的分析检验
3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底 物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物 都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉 淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和 两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能 生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以 根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物 才是真正由酶促反应所生成的产物量。
（二）酶活力测定的方法：
酶活力测定要符合两个原则： ①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与 反应时间t成正比， ②反应速度与酶量成线性关系，即 〔E〕= k(-〔s〕/ t) = k〔p〕/ t k(k〔 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法
如何测定酶活力？ 如何测定酶活力？
以产物浓度对反应时间作图， 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反 应速度曲线
产 物 浓 度
注意：初速度的 注意： 测定是关键， 测定是关键，为 什么？ 什么？
0
时间
可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着时间的延长，反应速度逐渐下降 随着时间的延长，
国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。 但也有不少缺点，如 ：①从惯用单位换算成国际单位比较麻 烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白 酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微 摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时， 其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的 不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这 也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不 同的。
【重点掌握】 重点掌握】
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
酶活力及蛋白含量测定
酶活力的测定：
1 ． 样 品 前 处 理 ： 测 定 E1 、 E2 、 E3 酶 活 时 ， 用 pH4.6, 0.2mol/L的醋酸缓冲液进行稀释。（E1稀释5倍、10倍、 20倍；E2稀释50倍、100倍; E3稀释20倍，50倍）
取两支试管分别加入用 pH4.6,0.2mol/L 的醋酸缓冲液适 当稀释过的酶液2ml； 一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（对 照取E1 20倍稀释 1管即可）； 另一支做测定管； 把两支试管和 5% 的蔗糖溶液放入 35 ℃水浴中预热恒温 （10min）； 分别取 2ml 5% 的蔗糖加入上述两试管中，开始计时，准 确反应3分钟，于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇 匀，终止反应。
蛋白含量的测定：
样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀 成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测定）同 工作曲线的制作。 蛋白质浓度的计算：
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
Pr (mg/ml)=
测定E1蛋白含量（大约稀释200、100倍），测定E2蛋白 含量（大约稀释50、20倍），测定E3蛋白含量（大约稀 释50、20、10倍），用去离子水稀释即可。
[E] = (葡萄糖mg数×(4.5/0.5)×E的稀释倍数/2ml)/2
蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克 还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 注意：在测定E1、E2、E3酶活力和蛋白浓度时，应留取少许样 品（100μml左右），留作电泳实验。 注：在正交试验的测定中，共需稀释到50U/mL的E3约为12mL。
2. 酶活力的测定：从两个反应试管中各取出 0.5ml 溶液放入血 糖管中，加入 3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和 1.5ml 水，摇匀， 于沸水浴中准确反应 5min，立即用冷水冷却，加水稀释至 25ml，摇匀，于540nm的葡萄糖含量毫克数，按下面公式计算酶活力：
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
《酶活力的测定》课件
数据记录与整理
实验数据记录
在实验过程中，应准确、及时地记录实验数据，包括实验条件、实验步骤、实 验结果等。
数据整理
将实验数据整理成表格或图表，便于分析和比较。数据整理时应确保数据的准 确性和完整性。
数据分析与处理
数据分析
对实验数据进行统计分析，包括平均值、标准差、误差等指 标的计算。
数据处理
对异常值或离群数据进行处理，如剔除、替换或修正，以确 保数据分析的准确性。
未来，酶活力测定技术的发展将更加注重高灵 敏度、高特异性和自动化方向，为生物工程领 域的研究提供更加精准和高效的工具。
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THANKS
问题
实验操作复杂，耗时较长。
改进建议
优化实验流程，简化操作步骤，提高实验 效率。
酶活力测定在生物工程领域的应用前景
酶活力测定是生物工程领域中重要的研究手段 ，可用于研究酶促反应动力学、酶的抑制剂和 激活剂等方面的研究。
随着生物工程技术的不断发展，酶活力测定的 应用范围将不断扩大，如应用于生物制药、生 物能源和生物环保等领域。
通过实验，我们掌握了酶活力测定的基本原理和方法，学会了如何设置实验条件和 操作实验。
实验过程中，我们观察到了酶促反应的动力学特征，如米氏方程的适用性和酶促反 应的速率常数。
实验中存在的问题与改进建议
问题
改进建议
实验过程中存在误差，如温度控制不精确 、底物浓度不均匀等。
采用更精确的仪器和设备，如恒温控制器 和磁力搅拌器，以提高实验的准确性和可 重复性。
米氏方程是描述酶促反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为V=Vmax[S]/（Km+[S]），其中V代表反应速率，Vmax代表 最大反应速率，[S]代表底物浓度，Km代表米氏常数。
第6章酶化学 第五节 酶的活力测定
第六章 酶化学
• 第一节 概述 • 第二节 酶的命名和分类 • 第三节 酶催化反应的机理 • 第四节 影响酶促反应速率的因素——酶促反应动力学 • 第五节 酶的活力测定 • 第六节 食品工业中重要的酶及其应用
食品生物化学
学习目标
1.掌握酶的化学本质及作用特点。 2.了解酶的命名及分类。 3.掌握酶催化反应的机理。 4.掌握温度、pH、酶浓度、底物浓度、竞争性抑制、非竞 性抑制物及激活剂对酶促反应速率的影响。 5.掌握酶活力的概念及测定酶活力的方法。 6.熟悉食品工业中重要的酶及其应用，了解固定化酶。
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第五节 酶的活力测定
一、酶的活力和活力单位
1．酶活力
通常用单位时间内酶催化某一化学反应的能力来表示酶的 催化能力，即用酶活力大小来表示酶的催化能力。酶活力的大 小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表 示，两者呈线性关系。酶催化的反应速率愈大，酶的活力愈高； 反应速率愈小，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定 酶促反应的速率。由于酶催化某一反应的速度受多种因素限制， 故一般规定在某一条件下(恒温、使用缓冲溶液)用反应速率的 初速率来表示酶活力。
60 20 2% 1 1000 4800单位/ 克酶制剂
10
0.5
2．测定一定时间内所起的化学反应量
这是酶活力测定的主要方式，用测定反应量来计算酶活力。 主要是根据在一定条件下，酶反应速率与酶浓度成正比，测定 反应速率就可求出酶的浓度。
食品生物化学
测定结果的正确与否，即能否真实地反映酶活力，是和酶 反应的条件是否适宜密切有关。适宜的条件是使所有的酶分子 都能正常地发挥作用，反应条件中应使酶浓度是影响反应速率 的唯一因素，而其他条件如pH和温度应保持最适水平。此外测 定用的底物应当使用足够高的浓度，使酶催化的反应速率不受 底物浓度的限制。为了测定简便，选用的底物最好在物理或化 学性质上和产物有所区别。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法有多种，下面列举常用的几种方法：
1. 比色法：通过测定酶反应产生的可见光吸收或色素形成来间接测定酶活力。
常用的比色法有尼林蓝法、间苯二酚法、对苯二酚法等。
2. 发光法：利用酶催化的氧化还原反应产生的发光信号来测定酶活力。
常用的发光法有荧光发光法、葡萄糖氧化酶法等。
3. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
4. 毛细管电泳法：通过测定酶催化反应产生的电荷变化、离子浓度变化或pH 值的变化来测定酶活力。
5. 凝胶电泳方法：通过观察酶在凝胶上的迁移距离或酶活性的带状图案的强度来测定酶活力。
6. 标记物法：利用酶催化与标记物反应产生的物质变化来测定酶活力，常用的标记物有放射性同位素、酶标记物等。
以上是常用的酶活力测定方法，不同方法适用于不同类型的酶和反应体系。
在实
际应用中，需要根据具体情况选择最合适的方法来测定酶活力。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
酶活力测定的方法
酶活力测定的方法
酶活力测定可是个超级重要的事儿呢！就好像我们要了解一个运动员有多厉害，得看他在赛场上的表现一样。
那怎么去测定酶活力呢？嘿，方法可多啦！
一种常见的方法就是比色法。
这就好比我们通过观察颜色的变化来判断事情的进展。
通过特定的化学反应，让酶和底物作用，然后产生一些有颜色变化的物质，我们根据颜色的深浅来衡量酶活力的高低。
你说神奇不神奇？
还有一种是荧光法，哇哦，这就像是在黑暗中找到那闪闪发光的宝贝。
利用酶反应会引起荧光强度的变化，从而准确地知道酶活力的大小。
再说说同位素测定法，这可有点高科技的味道了呢！就如同有个超级侦探在追踪着微小的线索。
通过标记同位素，然后观察它们的变化，来确定酶活力。
另外，电化学法也不能小瞧呀！它就如同一个敏锐的传感器，能精确地捕捉到微小的电信号变化，进而反映出酶活力的情况。
这些方法各有各的奇妙之处，各有各的用处。
我们可以根据不同的酶、不同的实验条件去选择最合适的方法。
难道不是吗？
酶活力测定在生物、医学、化学等领域都有着至关重要的地位。
它就像是打开一扇门的钥匙，让我们能深入了解那些神奇的生物化学反应。
没有准确的酶活力测定，我们怎么能更好地研究疾病的发生机制？怎么能研发出更有效的药物？怎么能推动科学的进步呢？
所以啊，我们一定要重视酶活力测定，不断探索和改进测定的方法。
让我们能像超级英雄一样，揭开酶的神秘面纱，为人类的健康和科学的发展贡献自己的力量！这是多么有意义的事情啊！。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告酶活力测定实验报告引言：酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率，对于维持生物体内的代谢平衡起着重要的作用。
酶活力测定实验是一种常用的实验方法，通过测量酶催化反应中底物消耗量或产物生成量的变化，来间接反映酶的活性水平。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶（catalase）在不同温度下的活性变化，探究酶活性与温度之间的关系。
材料与方法：1. 实验仪器：分光光度计、恒温水浴槽。
2. 实验试剂：过氧化氢酶溶液、过氧化氢底物溶液、磷酸盐缓冲液。
3. 实验步骤：a. 在分光光度计中设置波长为240nm。
b. 准备一组含有过氧化氢酶、过氧化氢底物和磷酸盐缓冲液的混合溶液，作为实验组。
c. 将实验组的混合溶液分别置于不同温度的恒温水浴槽中反应一段时间。
d. 取出反应后的混合溶液，通过分光光度计测定其吸光度，得到反应速率。
e. 重复以上步骤，分别在不同温度下进行实验，并记录实验数据。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了不同温度下过氧化氢酶的活性变化曲线。
实验结果显示，随着温度的升高，过氧化氢酶的活性呈现出先增加后降低的趋势。
在较低温度下，酶的活性较低，反应速率较慢；随着温度的升高，酶的活性逐渐增强，反应速率也随之增加；然而，当温度超过一定范围后，酶的活性开始下降，反应速率逐渐减小。
这一结果可以解释为酶的活性受到温度的影响。
酶是一种蛋白质，其活性受到温度的变化而变化。
当温度升高时，酶分子内部的振动加剧，使得酶与底物之间的碰撞频率增加，酶活性增强；然而，当温度过高时，酶分子的结构开始发生变化，部分酶分子失去了原有的构象，导致酶活性下降。
这种变化可能是由于酶分子的部分构象发生变化，使得酶活性中心的空间结构发生改变，从而影响了酶与底物之间的互作用。
此外，实验结果还表明，酶活性与温度之间存在一个最适温度。
在最适温度下，酶的活性达到最高点，反应速率最快。
这是因为在最适温度下，酶分子的结构处于最稳定的状态，酶活性中心与底物之间的互作用最为紧密，因此反应速率最高。
酶活力测定
胰蛋白酶和木瓜蛋白酶活力测定
(1)胰蛋白酶活力的测定:将1.0mL胰蛋白酶底物溶液与1.0mL硼酸盐缓冲液混合。
调温至25℃、调pH至8.0后加入0.05mL胰酶溶液，用浓度为0.10mol/L的NaOH溶液滴定，使其pH值稳定在7.9～8.0范围内。
反应8min时读取NaOH溶液的消耗量(uL)，以每分钟水解1.0umol/L BAEE所需的酶量定义为一个胰蛋白酶活力单位。
胰蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.10×1000/(m×8)
式中，V为NaOH溶液的消耗量(uL)，0.10为NaOH溶液浓度(mol·L-1)，m为0.05mL酶液的酶量(mg)。
(2)木瓜蛋白酶活力的测定:将5.0mL木瓜蛋白酶的激活液和5.0mL
底物溶液混合，调温至25℃后加入0.lmL木瓜蛋白酶溶液，用浓度为0.02mol·L-1的NaOH溶液滴定，使其pH恒定在7.0左右。
反应5min 时读取NaOH溶液的消耗量(uL)，在上述条件下每分钟水解1.0 umol BAEE所需的酶量定义为一个木瓜蛋白酶活力单位。
木瓜蛋白酶活力(U·g-1)=V×0.02×1000/(m×5)
式中，V为NaOH溶液的消耗量(uL)，0.02为NaOH溶液浓度(mol·L-1)，m为0.lmL酶液的酶量(mg)。
酶活力测定方法
NH
NH-CO-
H2N-C-NHCH2CH2CH2-CH-COOC2H5
253nm处的A随酶促反应递增， 根据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能 转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性 单位。 测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12 次 重 复 进 样 3 个 峰 保 留 时 间 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0. 4%,0 .6% 和 0. 8%, 峰 面 积 的 Ｒ Ｓ Ｄ 分 别 为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品 37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进 样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起, 所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的Ｒ ＳＤ均分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系 统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分 析。
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱 完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳 定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较 有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面 积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰, 说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生 产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
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４. 计算 酶单位定义：在60℃，pH6.0 条件下，1h液 化1g可溶性淀粉的酶量为一个活力单位。 α- 淀 粉 酶 活 力 （ u/g 或 u/mL ） =20×0.2×60/t×1/0.5×1/m×n 式中 20---- 可 熔 性 淀 粉 吸 取 量 （ mL ） ； 0.02----1mL可溶性淀粉溶液中含可溶性淀粉 质 量 （ g ） ； t---- 酶 解 反 应 时 间 （ min ） ； 0.5----吸取稀释酶液体积（mL）； n----酶 液稀释倍数； m----称取酶粉的质量（g）。
２.试剂 （1）pH 4.6 0.1 mol/L HAc缓冲液； （ 2 ） 0.05mol/L Na2S2O3 标 准 溶 液 ， 称 取 13g Na2S2O3·5H2O 和0.2gNa2CO2，用新鲜煮沸 过的冷水溶液并稀释至1000mL配制一周后以 碘酸钾（或重铬酸钾）标定。 （3）0.1mol/L碘溶液 ，棕色瓶保存。 （4）1mol/L硫酸溶液。 （5）0.1mol/LNaOH溶液。 （6）20g/L可溶性淀粉溶液。 （7）200 g/LNaOH溶液。 （8）10g/L淀粉指示剂 。 2012-12-25 14
2012-12-25 15
酶活力测定： 于甲、乙两支比色管中，分别加入可溶性淀粉 溶液25ml和PH4.6乙酸缓冲液5ml，摇匀后至 40℃恒温水浴中预热5min。 在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇 匀，在此温度下准确反应30min,立刻各加NaOH 溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速冷却，并于 乙管（空白）中补加待测酶液2ml。吸取上述反 应液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶 液10ml，再加0.1mol/LNaOH溶液15ml，摇匀， 密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L硫酸 溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直 至蓝色刚好消失为其终点。不同稀释倍数，应做 相应的空白试验。
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２．试剂 原碘液：称取碘11g 、碘化钾22g用少量水使 碘完全溶解,然后定容至500mL,贮于棕色瓶中. 稀碘液：吸取2mL,加碘化钾20g,用水溶解并 定容至500mL,贮于棕色瓶中。 20g/L可容性淀粉溶液。此溶液需要当天配制。 pH6.0、0.02mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
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５. 讨论 （ 1 ） 商 品 α- 淀 粉 酶 粉 剂 活 力 为 1500 ～ 2500u/g，稀释倍数一般为100～200倍。 （2）可溶性淀粉的质量对α-淀粉酶活力有一 定影响，为统一起见，可溶性淀粉采用浙 江菱湖淀粉厂产的酶制剂专用可溶性淀粉。2-25
4
３. 测定步骤 待测酶液的制备：称取酶粉1.000g（或吸取 液体酶1.00ml），先用少量的pH6.0缓冲液溶 解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量 瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复 捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲 液定容至刻度（将酶液稀释至被测试液吸光度 在0.12-0.36范围内），摇匀。同过四层纱布过 滤，滤液为待测酶液。
第十一章、酶活力测定
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第一节、α-淀粉酶活力测定
1、作用 2、分类 3、测定方法
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一、分光光度法
１. 原理 α-淀粉酶广泛存在于植物、哺乳类动物和微 生物中。能将淀粉分子链中的α-１,４葡萄糖甘 键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽 糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特异性 反应迅速逐渐变红棕色直至消失，其颜色消失 的速度与酶活力有关，故可通过测定反应后吸 光度计算其酶活力．
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３. 测定步骤： 待测酶液的制备：同“分光光度法” 测定：取2ml标准终点色溶液于白瓷板孔穴内，作为 比较颜色的标准，其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取 可溶性淀粉溶液和5mLpH6.0缓冲液于试管中。在 60℃恒温水浴中预热10min。然后准备加入0.5mL稀 释酶液，立即记时。充分摇匀。定时用滴管取出约 0.5mL反应液，滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴内，当 孔穴内颜色由蓝紫色逐渐变为与标准终点色（红棕色） 相同时即为反应终点，记录反应时间t（min）。
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酶活力测定：吸取可溶性淀粉溶液20ml与 试管中，加入pH6.0缓冲液5ml，摇匀后于 60℃恒温水浴中预热10min。加入稀释好 的待测酶液1ml。立刻计时，摇匀，准确 反应5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液 作空白波长660nm，1cm比色皿，迅速测 定吸光度（A）根据吸光度查表，求得测 定酶液的浓度（c）。
第二节糖化酶活力测定
１.原理 糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养 源的所有生物中。糖化酶催化淀粉水解， 从淀粉分子非还原性末端开始，分解α1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子 中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量 的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫 酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。
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１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的 糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
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２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。 稀碘液：同“分光光度法”。 20g/L可溶性淀粉溶液：同“分光光度法” PH6.0、0.02mol/L Na2HPO4—柠檬酸缓冲液 标准终点色溶液 甲液：准确称取氯化钴40.2439g和重铬酸钾0.4878g， 用水溶解并定容至500ml。 乙 液 ： 准 确 称 取 铬 黑 T 40mg, 用 水 溶 解 并 定 容 至 100ml。 取甲液40ml与乙液5.0ml混合，即为标准终点色溶液。 该溶液在冰箱内保存，使用15d后需重新配制。
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４.计算 酶活单位定义：在60℃，pH6.0条件下， 1h液化1g可溶性淀粉的酶量为1个酶活力 单位。 α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=c×n 式中c----测试酶液的浓度（u/ml）； n----样品的稀释倍数。 以结果表示至整数。
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二、目视比色法
二、物理化学分析法
３.测定步骤 待测酶液的配制，称取酶粉，准确至0.0002g （或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸 缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清夜小心 倾入适当的容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓 冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶 中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。通过四层纱 布过滤，滤液供测定用。