酶法生产r-氨基丁酸工艺实验

生物工程工艺大实验

——酶法生产r-氨基丁酸工艺实验

一、实验目的与原理

1、实验目的

实验设置涉及生物产品氨基丁酸生产过程的基本单元操作和方法，强调锻炼基本操作能力，学习控制发酵培养基的配制与发酵罐的操作。掌握各种发酵实验仪器的使用方法及注意事项；掌握r-氨基丁酸酶法生产工艺，熟悉用浓缩等电法等从发酵液中提取氨基丁酸的基本流程。

实验原理

本实验利用酶法即用大肠杆菌对L-谷氨酸进行发酵，在L-谷氨酸脱羧酶作用下脱羧生成GABA和二氧化碳来制备GABA。

高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

离心原理：利用超高速的离心机将菌体与菌液分离。

活性炭脱色：利用活性碳的吸附能力将溶液中的杂质吸附除去。

抽滤：减压过滤也就是抽滤,利用抽气泵使抽滤瓶中的压强降低,达到固液分离的目的。

减压浓缩：使用抽真空的方式降低水的沸腾温度使水蒸发干燥。

乙醇沉淀：伽马-氨基丁酸易容与水而不溶于乙醇，所以利用乙醇沉淀。

2、实验流程

二、材料与方法

1、菌种

大肠杆菌GABA1210

2、主要仪器

HYG-Ⅱ迴转式恒温调速摇瓶柜 GZX-9140 ME数显鼓风干燥箱

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 KQ-C型全自控蒸汽发生器

BIOTECH-2002 BIOPROCESS CONTROLLER PA98-2空气压缩机

RS-232Ⅱ精密电子天平 YP1200电子天平

FORMA 700 SERIES-80℃冷藏箱 DINGLI LD5-10离心机

LDH系列生化培养箱 SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵

Heidolph G3减压浓缩机

试管若干、锥形瓶、烧杯、玻璃棒、移液管、酒精灯、量筒

3、主要试剂

葡萄糖，玉米浆，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，乳糖，酵母粉，VH，青霉素，琼脂条，氢氧化钠固体，氢氧化钠溶液，活性炭，无水乙醇，L-谷氨酸

4、分析方法

4.1、菌种培养过程

首先进行菌种活化，然后将大肠杆菌接种到固体斜面培养基（LB培养基+100mg/L 青霉素）进行一代培养（37℃。12h），其后将固体斜面培养基上的菌种再进行二代培

养（37℃，12h），再将二代菌种接种到种子培养基（葡萄糖0.3%，玉米浆3%，氯化钠

0.5%，磷酸二氢钾0.1%， pH7.0，121℃15min）进行摇床培养，最后将种子培养基中的菌种接种到发酵罐（葡萄糖0.3%，乳糖1.6%，玉米浆3%，酵母粉0.3%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VH 1 mg/L， pH7.0，115℃15min。）进行发酵培养，培养条件为pH7.0，温度34-36℃培养至OD600nm*20=10-15，培养时间8-10h。

4.2、谷氨酸测定

将反应结束后的发酵液放入离心管中进行离心，然后取离心管中的上清液放入仪器中用酶膜法进行谷氨酸的测定。

4.3、残糖测定

在大肠杆菌生长至对数生长末期至稳定期时，离心，过0.22 um膜。取不含菌体的滤出液用三五二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量。

4.4、pH测定

在配置培养基过程中要用pH6.4-8.0精密pH试纸测定培养基pH。发酵过程中，要用广泛pH试纸对发酵液的pH进行测定。酶促反应过程中，用pH6.4-8.0精密试纸对pH进行检测。

4.5、吸光度测定

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）

3.根据所需波长转动波长选择钮至600nm处。

4.将空白液即蒸馏水及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

4.6、氨基丁酸的测定

用活性炭吸附溶液中的蛋白，加入无水酒精沉淀，其后减压浓缩结晶、抽滤得晶体9.1g，理论收率为65%。

三、实验过程与结果

1、发酵培养

1.1、摇瓶种子培养记录

种子接种量：100ml×5 pH＜6.4 培养时间：21：30-8：00共10.5h、

OD600*20：0.258 转速：172r/min 测量温值PV：28.9 设定温值SV：30.0 1.2、发酵培养记录

批号：20141225

30L发酵罐发酵记录

时间/h pH 溶氧/% 转速/rpm OD600风量L/min 罐压/MPa 温度/℃

0.14 8.52 177.7 300 0.061 5.7 0.069 33.2

1.00 6.17 139.2 300 O.059 3.8 0.032 35.8

2.00 6.20 122.8 300 0.081 2.3 0.024 35.9

3.00 6.45 91.7 300 0.116 2.2 0.023 36.0

4.00 6.31 6

5.3 350 0.148 2.4 0.023 3

6.0

5.00

6.31 52.8 410 0.204 2.4 0.023 36.0

6.00 6.31 48.5 450 0.298 2.3 0.023 36.0

7.00 6.61 76.7 500 0.397 2.0 0.023 36.0

8.00 6.63 41.7 419 0.447 0.8 0.015 36.0

9.00 6.70 58.9 419 0.730 0.8 0.015 35.9

10.00 6.81 84.1 399 0.608 0.8 0.015 35.8

过程：每隔一小时取少量发酵液于试管中，取0.5ml发酵液与9.5ml水混合，测OD值。PH、溶氧均可用电极直接测出。当溶氧低于30%，要适当提高转速以增加溶氧。

2、菌体收集

项目体积菌体OD

过滤前发酵液3L 0.258

过滤后发酵液2L 0.608

过程：发酵完成后，将发酵液进行过滤并测量OD值。

3、酶催化反应

菌体量反应液体积投料谷氨酸量反应温度反应pH 反应时间

0.5L 0.65L 100g ＜36℃ 4.0 4h

过程：取冷冻后的菌液进行离心，分离菌体与上清液，将谷氨酸加至上清液进行酶促反应，在恒温条件下谷氨酸转化为伽马-氨基丁酸，因为脱羧产生二氧化碳，反应时会有大量气泡产生。

4、氨基丁酸的提取

4.1离心

料液体积离心时间转速离心后体积

500ml 10min 3500r/min 450ml

过程：将反应液置于离心机中，经高速离心，得上清液。

4.2 脱色实验