高密度发酵.

通过发酵条件的改进可以减少乙酸 的产生，但是难以做到精细的调控，通过 切断细胞代谢网络上产生乙酸的生物合成 途径，构建出产乙酸能力低的工程化宿主 菌，是从根本上解决问题的途径之一。
①阻断乙酸产生的主要途径：基因敲除 或突变产生乙酸代谢突变菌株。
②对碳代谢流进行分流：丙酮酸代谢有 选择的向乙醇的方向进行。
一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的初始物料的特点 ①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养
基的来源及其质量。③生产工艺及条件。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求。
二、分离纯化的基本过程 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从
正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要 高于传统产品。
第九节 高密度发酵
高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓 度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达 200gDCW/L。
高密度发酵可以提高发酵罐内的菌体密 度，提高产物的细胞水平量，相应的减少了生 物反应器的体积，提高单位体积设备生产能力， 降低生物量的分离费用，缩短生产周期，从而 达到降低生产成本，提高生产效率。
四、固液分离
1、离心沉淀 2、膜过滤：微滤；超滤；反渗透 3、双水相萃取：两种水溶性高聚物或
可处理少量样品，产生热量大，敏感物 质易失活。
2、化学破碎法
渗透冲击：先将细胞置于高渗透压介质， 达成平衡后，突然稀释介质，在渗透 压的冲击下，使细胞壁和膜膨涨破裂。
适用于细胞壁较脆弱的，经过酶处理的 细胞壁。
增溶法：利用表面活性剂等化学试剂的增溶 作用，增加细胞壁和膜的通透性使细胞破 碎的方法。
氮源、微量元素和无机盐对细菌的生 长繁殖和外源蛋白的表达也有很大影响。
2 溶氧浓度
随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增 加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。 特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的 扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均 不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓 慢，外源蛋白的表达量也较差。
表面活性剂：SDS；TritonX-100 有机溶剂：乙醇；异丙醇，尿素 缺点：添加新的化学试剂，造成新的污染。
3、生物破碎法
酶溶法：利用生物酶消化溶解细胞壁和细 胞膜的方法。
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物，必须根 据待处理细胞的结构和化学组成来选择 适当的酶，并确定相应的使用次序。
价格高，回收利用困难，仅在实验室用。
控诱导表达的基因工程菌来说，诱导 时机和持续时间对于重组蛋白的产量 由很大影响。
5 代谢副产物 乙酸 二氧化碳
葡萄糖的浓度超过某一阈值，会产生乙酸， 或者比生长速率过高，供氧不足，也会产生乙 酸。为降低培养基中代谢副产物的积累，可采 用流加补料的措施，或保持适当的比生长速率， 或在培养基中添加某些氨基酸。
二 、实现高密度发酵的方法
1 发酵条件的改进 ①培养基的选择：采用甘油作为碳源 ②建立流加式培养：营养过高抑制细胞生长，高
密度发酵是以低于抑制阈的浓度开始的，营养 物是在需维持高生长速率是才添加的。 ③提高供氧能力：通入空气与氧混合气体；增加 压力；发酵液中添加过氧化氢。
2 构建出乙酸化能力低的工程化宿主菌
一、影响高密度发酵的因素
培养基；溶氧； pH；温度；代谢副产物
1 培养基:高密度发酵对基质中营养源的种类 和含量比要求较高，如碳源和氮源的比例偏 小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰 老自溶；比例偏大，则菌体繁殖数量少，细 胞代谢不平衡，不利于产物积累。
葡萄糖是高密度发酵中常用的碳源， 但浓度过高，会产生乙酸，因此要保证较 低的葡萄糖浓度。
的将目的产物分离，达到较高的纯化倍 数。
③收率要高。
④两个技术间能直接衔接，不需 要对物料加以处理。
⑤纯化过程要快，满足高生产率 的要求。
三、细胞的破碎方法
➢物理法：匀浆法；珠磨法和超声法 ➢化学法：渗透冲击，增溶法 ➢生物法：酶溶法
1、物理破碎法
匀浆法：利用高压迫使细胞悬浮液通过针 形阀后，因高速撞击和突然减压而使细 胞破裂的方法。
在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度， 必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。
在一定范围内，通气量越大，溶氧浓 度越高。
若气流速度过大，会使发酵液产生大 量泡沫，使罐的有效利用率降低。
3 pH 大肠杆菌利用葡萄糖产酸产气，
特别是大量的乙酸和二氧化碳，使pH 降低，必须调节pH在适宜的范围。
4 温度 培养温度在适宜的范围，对于温
可以大规模应用，不适用于易造成堵塞的 团状或丝状真菌。
高速磨珠法：将细胞悬浮液与研磨剂一 起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以 及玻璃珠与细胞间的相互剪切、碰撞 促进细胞壁破裂而释放出内含物。
产生大量的热，必须采取冷却措施。
超声破碎法：利用超声波来处理细胞悬 浮液，在超声波作用下，液体发生空 化作用，空穴的形成、增大和闭合产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破 碎。
第八节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物的分离、纯化非 常重要。表达的产物都是多肽或蛋 白质 。它的制得具有以下特点：
①表达产物在初始料中含量较低； ②初始物料组成复杂，含有大量细胞及代谢产
物、残留培养基等。 ③表达产物稳定性差，易失活变性； ④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； ⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。
③限制进入糖酵解途径的碳代谢流：大 肠杆菌对葡萄糖的摄取是在磷酸转移酶 系统的作用下通过基团转位的方式进行 的，通过基因敲除法限制葡萄糖的摄取 速率。
④引入血红蛋白基因：提高大肠杆菌在 贫氧条件下对氧的利用率。
3 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主 菌
对于以可溶性或分泌形式表达的目 标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水 解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解 酶的作用而被降解。
基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5 个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初 步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工
发酵液
胞内产物
细胞破碎 复性
细胞碎片分离
胞外产物
浓缩
初步分离
高度纯化
制剂
基因工程药物分离纯化的一般流程
产品
分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物中有效