银耳提取银耳多糖工艺流程-12

银耳提取银耳多糖工艺流程
一、综述
1、银耳
银耳又名白木耳，是一种高等真菌，性味甘、平、具有滋阴润肺、养胃生津之功效，自古以来被人们看作是延年益寿的佳品，是世界公认的最珍贵的食用菌和重要药材。

银耳子实体中除银耳多糖物质外，还含有一定量的果胶质、蛋白质、粗纤维等成分，这些物质的存在，将不利于多糖物质的提取分离和纯化。

2、多糖
多糖又名多聚糖，通常由多个单糖分子通过缩合、失水从而由甘糖键结合而成的一类分子结构复杂的高分子化合物。

根据其脱水缩合的成分不同，可分为均一性多糖、不均一性多糖。

多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖、调节身体免疫力等多种作用。

3、银耳多糖简介
银耳多糖( Tremella polysaccharides，TP) 是银耳的重要活性成分( 约占银耳干重的60%-70% ) ，是从银耳子实体或液体深层发酵的银耳孢子中提取出来的一种活性多糖。

大量研究表明，从银耳中提取分离得到的银耳多糖具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变、抗肿瘤等作用，能增强机体耐缺氧能力，清除自由基。

1.1银耳多糖的组成
银耳多糖的主链是由α-(1-3)-糖苷键组成的甘露聚糖，主链的2，4，6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及普通糖醛酸等残基组成的侧链，其活性中心是α -(1-3)-甘露聚糖这一共同结构部分。

银耳多糖种类包括酸性杂多
糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖和酸性低聚糖五种，不含核酸、蛋白
质类物质[3]。

1.1.1酸性杂多糖
约占银耳总多糖的70%~75%，为木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸为主的多聚
体，中有少量岩藻糖。

1.1.2中性杂多糖
约占银耳总多糖的20% 左右，为木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的多聚
体。

1.1.3胞壁多糖
根据文献报道，一种是从胞壁外层产生的酸性多糖，由D-葡萄糖醛酸、
D-甘露糖和D-木糖组成；另一种为碱性多糖，由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、
D-甘露糖和D-木糖组成。

1.1.4胞外多糖
结构以a-(1-3)连接的甘露糖为主链。

1.1.5酸性低聚糖
2、银耳多糖的提取及制备
银耳中含有丰富的银耳多糖，主要采用热水浸提、碱浸提法、酶法提取、辅以超声波或微波处理，对多糖进行提取；然后经Sevage法除蛋白、双氧水或活性炭脱色、乙醇沉析分离，再经透析法、超滤法或层析法纯化，最后经干燥、粉碎，得多糖成品。

因含有胞壁多糖，破细胞壁技术就成为提高提取多糖得率的主要因素。

2.1银耳多糖常用的提取方法
2.1.1热水浸提法
最常用的方法，用水来作为溶剂。

优点：简单易操作。

来了很大的困难，提取效率低和费时；水提取的银耳多糖主要是中性多糖和胞外多糖，多糖的得率普遍较低。

2.1.2碱浸提法
银耳中的多糖主要有中性多糖和酸性多糖。

银耳中的一部分酸性多糖在中性条件下不能继续溶出，因此在一定碱性条件下提取银耳多糖，会提高提取得率。

虽然碱处理使多糖含量增加，但碱浸提法容易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构。

2.1.3酶解提取法
酶提法是通过酶反应将原料组织分解，一出去细胞壁和膜上的果胶，纤维素以及蛋白质从而降低提取难度，有利于细胞壁内多糖的溶出，使多糖的提取率提高。

酶提法的一般方法为按照一定料液比加入样品干粉和生物酶，蒸馏水，在合适的温度和pH至下酶解一定时间，然后升温。

酶在一定的温度下提取一段时间，离心取上清液即可测定多糖的含量。

优点：由于真菌内壁成分复杂，而单一酶提法不能完全提取出全部的银耳多糖，所以利用多种酶复合产生协同作用，充分破坏菌体细胞结构，最大限度的提高多糖的提取率。

缺点：酶提法使银耳多糖获得率大幅度的增加还具有提取条件温和，提取时间短，对多糖损伤小，杂质易除的优点，但是酶的价格较高，又容易失活，在实验中温度控制要求十分严格（酶对于温度的变化十分敏感），且多糖的高级结构，可能因为酶的作用而改变。

2.1.4超声波辅助提取法
利用超声波激荡空气产生震动的原理，对银耳有极大的压力，造成真菌细胞壁以及整个生物体破裂，同时超声波产生的刺激效应如机械振动，乳化扩散，击碎，化学效应等也能加速真菌细胞内多糖的释放，扩散及溶解，因而能很好的提高多糖的提取率。

优点：具有提取效率高，提取时间短，提取温度低，多糖结构稳定等优点缺点：超声波提取时间不宜过长，否则会造成糖苷键的断裂而导致提取率的降低。

2.1.5微波辅助提取法
微波辐射导致植物细胞内的极性物质尤其是水分子，产生大量热量，使得细胞内的温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减小，细胞收缩，表面出现裂纹。

由于孔洞和裂纹的存在，胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放胞内多糖。

优点：微波加热的热效率高，温度升高快速而均匀，因此，应用微波加热提取手段，能够显著缩短萃取时间，较大程度地提高多糖的萃取效率。

缺点：微波的频率很高，能深入渗透物体，对细胞的结构有较大作用。

2.1.6酸、碱提法
酸碱法提取银耳多糖，通过酸碱液的充分作用，使得银耳的细胞，细胞壁充分吸收水分膨胀而破裂从而使银耳多糖充分游离出来，提高多糖的获得率。

优点：能够一定程度提高多糖的产率。

缺点：由于使用酸作为提取的介质，会破坏糖苷键，间接地造成多糖的得率，还可能会对容器造成腐蚀，除弱酸外不宜采用；而使用碱提法生成的溶液浓度过大，会造成过滤的困难，影响产量。

2.2银耳多糖的分离纯化
采取不同工艺方法得到的银耳多糖纯度不同，提取液中含有蛋白质、无机盐以及其他一些小分子物质，需进一步纯化。

由于多糖是大分子物质，成分复杂。

目前多糖纯化的工艺流程：乙醇等低分子有机溶剂沉淀→脱蛋白→脱色→脱盐→多糖的各组分分离纯化
2.2.1乙醇等低分子有机溶剂沉淀
大部分多糖在高浓度的有机溶剂中是几乎不可溶的，因而可以用有机溶剂对多糖进行沉淀从而去除溶液中的非多糖杂质，甲醇、乙醇和丙酮是最常
度越高，能够沉淀下来的多糖分子量越小，当醇浓度达80%时，几乎所有多糖包括小分子的多糖（单糖、双糖、三糖及四糖）都能沉淀下来。

2.2.2脱蛋白
根据文献报告，多糖经过去蛋白后，生物活性有显著提高。

根据蛋白质易变性的性质，目前采用有机溶剂沉淀法、盐析法、等电点沉淀法等。

其中有机溶剂法有三氯乙酸法、鞣酸法、sevage法、盐酸法、酶法、酶法与sevage法联合使用等。

2.2.3脱色素
色素影响菌类的纯度和色泽，甚至可能影响多糖的品质和结构变化。

常用的脱色方法有过氧化氢法、活性炭吸附法、离子交换树脂法等。

2.2.4多糖的各组分分离纯化
提取的多糖是个复杂的混合物，具有多种不同种类的糖类化合物，为了研究各组分之间的生物活性及差异性，需对多糖提取液进一步的分离。

常见的多糖分离纯化方法有：有机溶剂分级沉淀法、盐析法、季铵盐沉淀法、层析柱法（离子交换柱层析法和凝胶柱层析法）、超滤法。

2.3银耳多糖的干燥方法
银耳多糖由于本身高极性、难挥发、热不稳定的性质，不适用加热干燥方法制备。

现行银耳多糖干燥工艺为将纯化后的多糖提取液用无水乙醇进行沉淀处理，然后通过高速离心脱水得多糖沉淀物，最后经冷冻干燥得多糖干粉。

二、实验设计
银耳多糖是银耳中重要的活性成分，且其含量能占到银耳干重的百分之六十以上。

通过微波辅助法提取银耳多糖，首先对热水浸提下三个提取条件分别设计单因素试验。

然后对微波辅助提取下三个提取条件分别设计单因素实验。

然后根据单因素实验得出最佳范围，然后再根据所得出的范围做三因素三水平的正交实验。

从而得出最佳的提取条件组合。

1、主要材料与仪器
材料：银耳、无水乙醇、氯仿、正丁醇、无水葡萄糖、牛血清清蛋白、98%浓硫酸、考马斯亮蓝G-250、苯酚
仪器：灭菌锅、豆浆机、微波反应系统、离心机、紫外分光光度计、鼓风干燥箱、分析天平、恒温水浴锅、冷冻干燥机
2、实验流程
备注：提取加工流程：去离子水浸泡→固体打浆→微波提取→加热浸提
3、实验方法
实验一：热水浸提法
称取银耳2g，按2中的实验流程，选取不同的料液比（1：25-1：50
（g/ml））、提取时间（1h-6h）、提取温度（50℃-100℃）条件下进行单因素实验和正交实验，优化最佳提取条件。

实验二：微波辅助提取银耳多糖
称取银耳2 g，按2中的实验流程，选取不同的功率（200-1200w）、时间（5-30min）、温度（50-100℃）条件下进行单因素和正交实验。

然后将微波提取后的样品倒入烧杯中，继续在实验一的最优条件下热水浸提。

3.2银耳多糖的纯化
3.2.1sevage法脱蛋白
在粗多糖溶液中加入氯仿-正丁醇混合溶液，震荡使多糖中蛋白质充分变性，经离心脱除。

取30ml银耳多糖提取液于50ml的离心管中，加入7.5ml 的氯仿-正丁醇混合溶液，氯仿-正丁醇配置体积比为4：1，旋涡震荡，静置
5min，在转速为10000r/min下离心10min。

上层液为银耳多糖和sevage试剂混合溶液，下层为变性蛋白，弃下层，取上层多糖溶液，重复上述步骤除蛋白，直至无明显变性蛋白分层。

3.2.2醇沉多糖
将脱蛋白后的多糖溶液加入4倍85%无水乙醇沉淀多糖，经抽滤冷冻干燥得多糖干粉。

3.2.3 DEAE-52纤维素离子柱层析分离
一定量的DEAE-52纤维素加入适量的水，搅拌混均成悬浊液体，抽滤，用0.5mol/LNaOH浸泡1h，抽滤，去离子水洗涤至滤液为中性；用
0.5mol/LHCL浸泡1h，抽滤，去离子水洗涤至滤液为中性；再用
0.5mol/LNaOH浸泡1h，抽滤，去离子水洗涤至滤液为中性，加水混均，装柱。

将银耳粗多糖配置成109mg/ml的水溶液样品，所有备用洗脱液要超声脱气，先用去离子水平衡DEAE-52纤维素层析柱法，上样量5ml，流苏
1ml/min，先以多于一个柱体积的去离子水洗脱，再分别以0.2、0.4、
0.6mol/L的NaCL溶液进行梯度洗脱，每10ml收集一管。

合并同一洗脱峰的收集液，收缩，透析，冻干。

3.2.4 SephadexG-200凝胶过滤层析
将离子交换层析收集的第一个洗脱峰进行凝胶过滤层析，配制成5mg/ml 的多糖水溶液，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/l磷酸缓冲液
+0.15mol/lNaCL，流速为0.5ml/min，每管收集3ml。

收集主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干。

3.3杂质检测
3.3.1蛋白质的定性检测
若银耳多糖溶液在200 nm -400 nm 处无明显吸收蜂，表明银耳多糖中不含核酸和蛋白质等杂质成分。

考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质燃料，于蛋白质结合使之染色在595nm 处有最大吸收，常用来定性和定量测定蛋白质。

精密称取10.0mg牛血清蛋白于100ml容量瓶中用蒸馏水定容，震荡摇匀。

分别吸取0、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0ml于20ml具塞试管中，蒸馏水补充至1.0ml，接着加入5.0ml考马斯亮蓝G-250溶液震荡混均静置5分钟。

用紫外分光光度计在595nm处测定吸光值。

以标准牛血清蛋白的浓度为横坐标，测定的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并将它做线性回归处理，得线性回归方程。

取银耳多糖提取液1ml，测定脱除蛋白质前后的吸光值，做三组平行试验，最后取平均值，根据标准曲线中线性回归方程计算多糖提取液中蛋白值含量。

3.4银耳多糖含量测定
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，在490nm处测吸光度值。

采用苯酚-硫酸法测定银耳提取液中多糖质量浓度，即1 ml 银耳提取液中含多糖的质量，mg /mL。

测定方法：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，沸水浴显色15min以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

配制1mg/ml样品的水溶液，取100ul检测，做三组平行试验取平均值。

4. 设计
4.1银耳多糖热水浸提提取条件的单因素实验
4.1.1料液比对银耳多糖提取率的影响
在80℃下水浴加热3h，分别以1：25（g/ml）、1：30（g/ml）、1：35（g/ml）、1：40（g/ml）、1：45（g/ml）、1：50（g/ml）的料液比来提取银耳多糖，比较多糖得率，得出最佳提取料液比。

4.1.2提取温度对银耳多糖提取率的影响
在1：45的料液比下水浴加热3h，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的温度下提取银耳多糖，比较多糖得率，得出最佳提取温度。

4.1.3提取时间对银耳多糖含量的影响
在80℃、1：45的料液比下水浴加热，分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h 的时间下提取银耳多糖，比较多糖得率，得出最佳提取时间。

4.1.4银耳多糖热水浸提提取条件的正交实验
根据单因素实验的结果缩小每个提取条件的范围，再根据缩小后的范围进行三因素三水平的正交实验。

选取料液比（ A1（g/ml）、A2（g/ml）、A3（g/ml））、温度（ B1 ℃、B2℃、B3 ℃ ）、加热时间（ C1 min、C2 min、C3 min ）做三因素三水平的正交实验，详见表1。

表1 银耳多糖热水浸提提取正交试验
编号
A(料液比
（g/ml）)
B（加热温度/℃）
C（加热时间
/min）
1 A1 B1 C1
2 A1 B2 C2
3 A1 B3 C3
4 A2 B1 C2
5 A2 B2 C3
6 A2 B3 C1
7 A3 B1 C3
8 A3 B2 C1
4.2微波提取银耳多糖的单因素实验
4.2.1微波功率对银耳多糖提取率的影响
在100 ℃下微波加热15 min，在200-1200 W的范围内，分别以200 W、400 W、600 W、800 W、1000 W、1200 W的功率来提取银耳多糖，比较多糖得率，得出最佳功率值。

4.2.2加热时间对银耳多糖提取率的影响
在100 ℃微波功率为600 W，分别以5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 作为加热时间，考察加热时间的变化对银耳多糖结构和提取率的影响。

4.2.3加热温度对银耳多糖提取率的影响
微波功率600 W，微波加热时20 min，分别以50 ℃，60 ℃，70 ℃，
80 ℃，90 ℃，100 ℃为加热温度，考察不同加热温度对银耳多糖提取率的影响。

4.2.4银耳多糖提取条件的正交实验
根据单因素实验的结果缩小每个提取条件的范围，再根据缩小后的范围进行三因素三水平的正交实验。

选取微波功率（ D1W、D2W、D3W ）、加热温度（ E1 ℃、E2℃、E3 ℃ ）、加热时间（ F1 min、F2 min、F3 min ）做三因素三水平的正交实验（见表2 ）。

表2 银耳多糖提取正交试验
编号A(微波功率/W) B（加热温度/℃）C（加热时间/min）
1 D1 E1 F1
2 D1 E2 F2
3 D1 E3 F3
4 D2 E1 F2
5 D2 E2 F3
7 D3 E1 F3
8 D3 E2 F1
9 D3 E3 F2
通过正交试验结果分析可得影响银耳多糖提取效果各因素的主次顺序，从而得出最优试验组合。

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