农药残留快速检测生物传感器研究进展_朱赫

沈阳农业大学学报（社会科学版），2013－03，15(2)：129-133

Journal of Shenyang Agricultural University（Social Sciences Edition），2013－03，15(2)：129-133

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－９７１３．２０１３．０２．００１

农药残留快速检测生物传感器研究进展

朱赫，纪明山

（沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳１１０１６１）

摘要：迄今为止，农药残留快速检测用途生物传感器主要有酶生物传感器和免疫生物传感器两大类，农药残留快速检测用途酶生物传感器又包括胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基转移酶等七种类型，主要用于蔬菜、水果，以及食品中农药残留的快速检测。农药残留快速检测用途免疫生物传感器主要包括电化学、光学、压电和微机械悬臂梁四种类型，可以直接用于饮用水、果汁和葡萄酒等农药残留快速检测。

关键词：农药残留；快速检测；生物传感器；酶生物传感器；免疫生物传感器

中图分类号：Ｓ４８１．８；ＴＰ２１２．３文献标志码：Ａ文章编号：１００８－９７１３（２０１３）０２－０１２９－０５

一、生物传感器问题的提出

目前，中国食品安全已被空前地提到国家重视的高度，果蔬和肉禽等大宗农产品或食品快速检测技术成为衡量和监管食品安全的关键手段和措施。伴随科学技术的发展，生物酶、抗原抗体、全细胞、基因等生物活性物质均可用于生物传感器中生物分子识别元件制作，但用于食品中农药残留快速检测用途的生物传感器主要有酶生物传感器和免疫生物传感器两大类型，而包括微生物、动植物组织等全细胞生物传感器和基因生物传感器在农药检测方面应用研究很少。而且，全细胞生物传感器在农药检测方面的应用研究主要针对水资源污染监控［１］，基因生物传感器在农药检测方面应用研究主要针对农药引起的ＤＮＡ损伤检查［２］，两者在食品中农药残留快速检测上应用尚属空白，因此，就用于农药残留快速检测用途的酶生物传感器和免疫生物传感器的研究进展和应用情况做较详细的综述，旨在为农业领域生物传感器未来应用和发展提供一个清晰的研究背景。

二、酶生物传感器发展概况

迄今为止，已有胆碱酯酶、酪氨酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶、有机磷水解酶和谷胱甘肽巯基转移酶等七种活性酶被用于制作酶生物传感器，进行农药残留快速检测。其中前五种酶制作的酶生物传感器是测量酶抑制作用，而后两种是酶制作的酶生物传感器，直接测量酶促反应中所涉及的化合物。

（一）胆碱酯酶生物传感器

胆碱酯酶生物传感器是最早开发并且得到最广泛使用的酶生物传感器，主要用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测。从分子识别元件上的敏感材料角度，可分为单酶、双酶和三酶共三种类型。从信号转换元件角度，主要有电位型、电流型、离子选择性场效应管型、光学型、压电型等多种类型。

1.单酶型胆碱酯酶生物传感器乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）和丁酰胆碱酯酶（ＢｕＣｈＥ）常用底物乙酰胆碱或丁酰胆碱水解时都能电离出Ｈ＋，使溶液ｐＨ值发生变化，该变化值与消耗的活性物质浓度对数成正比，检测ｐＨ便可得待测物质的浓度。因此，可利用电化学方法，如电位测定法来检测，常用玻璃ｐＨ电极或对溶液ｐＨ值变化敏感的金属氧化物电极作基底电极，通过检测ｐＨ值变化来间接测定有机磷农药，其中，ｐＨ玻璃电极最简单、廉价［３］。使用人造底物硫代乙酰（丁酰）胆碱代替乙酰（丁酰）胆碱，这两种人造底物酶促水解生成的电活性硫代胆碱可以在Ｐｔ、玻碳等阳电极表面氧化，可设计成电流型酶电极。对Ｈ＋敏感的离子选择性场效应管（ＩＳＦＥＴ）也是制备胆碱酯酶生物传感器时常采用的信号转换器。它比玻璃电极检测灵敏度高，检测限可达１０－６ｍｏｌ／Ｌ［４］，响应

收稿日期：2013-02-03

基金项目：沈阳市大型仪器共享项目（２００７ＧＸ－０２）

作者简介：朱赫（１９８７－），女，沈阳农业大学博士研究生，从事农药学研究。

通讯作者：纪明山（１９６６－），男，沈阳农业大学教授，博士，从事农药学研究。

沈阳农业大学学报（社会科学版）第15卷速度快且不会随电极寿命而改变。光学胆碱酯酶生物传感器主要如下原理构建：在ＡＣｈＥ水解底物乙酰胆碱过

程中，生成的乙酸引起溶液ｐＨ降低，可引起溴甲酚紫、

氯酚红等ｐＨ指示剂的颜色变化［５］；ＣｈＥ抑制剂可引起竞争性抑制剂单磺酸基四苯基卟啉（ＴＰＰＳ１）与ＡＣｈＥ复合物的吸收光谱发生变化，即在４１２ｎｍ处吸光度降低［６］；ＡＣｈＥ催化乙酰巯基胆碱水解产物巯基胆碱可作为半导体材料价带空穴的电子施主，在ＡＣｈＥ抑制剂存在情况下，ＡＣｈＥ催化活性受到抑制，水解产物巯基胆碱量降低，引起光电流减小［７］。压电胆碱酯酶传感器是将ＡＣｈＥ固定在石英微天平晶体表面制成。石英晶体微天平（ＱＣＭ）传感器是质量敏感装置，能够测量极小的质量变化。

2.多酶型胆碱酯酶生物传感器胆碱酯酶生物传感器除单酶系统外，还有双酶和三酶系统。双酶生物传感器是将ＣｈＥ与胆碱氧化酶（ＣｈＯＤ）耦合。ＡＣｈＥ水解其天然底物生成胆碱和乙酸，由于胆碱没有电化学活性，使

用ＣｈＯＤ将胆碱氧化，消耗氧而生成Ｈ２Ｏ２，

可用电流型酶电极测定溶液中消耗的Ｏ２或生成的Ｈ２Ｏ２来检测有机磷农药。这种电流型双酶生物传感器检测限为３×１０－１８ｇ·Ｌ－１［８］。或者将ＡＣｈＥ与酪氨酸酶耦合构建双酶生物传感器［９］，对氧磷和毒死蜱的检测限分别为５．２×１０－６ｇ·Ｌ－１和０．５６×１０－６ｇ·Ｌ－１。Ｃｈｏｉ等则利用ＡＣｈＥ催化邻硝基苯乙酸水解生成黄色的邻硝基苯酚，以及谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）催化谷胱甘肽（ＧＳＨ）和１-氯-２，４-二硝基苯（ＣＤＮＢ）生成２，４-二硝基苯谷胱甘肽的反应，将ＧＳＴ和ＡＣｈＥ共同固定在胶膜上，可同时测定有机磷和硫醇类农药［１０］。三酶生物传感器则是将过氧化物酶添加到ＡＣｈＥ与酪氨酸酶耦合的双酶系统中制成。Ｋａｒｏｕｓｏｓ等使用这种三酶石英晶体微天平（ＱＣＭ）酶生物传感器用于测定有机磷和氨基甲酸酯类农药［１１］。

（二）有机磷水解酶生物传感器

有机磷水解酶生物传感器检测原理是：有机磷水解酶（ＯＰＨ）能催化有机磷农药中Ｐ－Ｏ、Ｐ－Ｓ和Ｐ－ＣＮ键水解生成酸和醇，这些水解产物通常是电活性或光活性物质，可以被转换成可测量的电或光信号，实现有机磷测

定。有机磷水解酶生物传感器主要有电位、

电流、电位－电流、离子选择性场效应管（ＩＳＦＥＴ）、光学等多种类型。起初的研究将ＯＰＨ直接交联在玻璃电极表面制成简单的电位型生物传感器［１２］，对二嗪农、对氧磷、对硫磷和甲

基对硫磷的检测限为２．０×１０－６ｍｏｌ

·Ｌ－１，其中检测对氧磷的灵敏度最高。电流型生物传感器基于ＯＰＨ水解对硫磷、对氧磷等生成的电活性对硝基酚（ＰＮＰ）在阳极氧化形成电流来测量酶促反应的速率。Ｓｃｈ觟ｎｉｎｇ等将ＯＰＨ通过胱胺／戊二醛交联技术固定在微制作金电极和具有场效应的结构板上，前者作为电流响应电极，后者作为电位响应电极；再将电极与流动注射分析系统相连，开发出一种电位-电流型ＯＰＨ生物传感器［１３］，可区别对氧磷、对硫磷、敌敌畏和二嗪农的检测，且检测浓度都在１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１级。Ｆｌｏｕｎｄｅｒｓ等将ＯＰＨ和氨丙基三乙氧基硅烷（ＡＰＴＳ）通过戊二醛共价交联在溶胶凝胶修饰的以Ｓｉ２Ｎ４为敏感层的栅极上，制成ＩＳＦＥＴ型酶生物传感器［１４］，采

用差分电路来实现整个检测过程，在小于１０ｓ的响应时间内，能检测到低达１０－６ｍｏｌ

·Ｌ－１的对氧磷。光学ＯＰＨ生物传感器则是将异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）、半萘基荧光素（ＳＮＡＦＬ）等荧光物质与ＯＰＨ共价固定在聚乙二醇水凝胶上制成光学敏感元件，采用荧光光谱测定法检测有机磷浓度。

（三）磷酸酶、酪氨酸酶生物传感器

磷酸酶生物传感器分为碱性磷酸酶生物传感器和酸性磷酸酶生物传感器两类。碱性磷酸酶（ＡＬＰ）除催化底物磷酸单酯水解成乙醇和磷酸盐外，还会受到各种不同化合物的抑制。利用不同酶底物开发检测农药的ＡＬＰ生物传感器。如根据测量ＡＬＰ催化化学发光底物去磷酸化所产生的光强度，开发出化学发光ＡＬＰ生物传感器，用于检测对氧磷［１５］；利用ＡＬＰ催化１-萘基磷酸酯水解成荧光１-萘酚，开发出荧光ＡＬＰ生物传感器，用于检测有机氯、农药（氨基甲酸酯和杀螟松）、重金属和ＣＮ－［１６］；利用３-吲哚酰磷酸酯、磷酸苯酯或维生素Ｃ-２-磷酸酯作酶底物，开发出电化学ＡＬＰ生物传感器，用于检测马拉硫磷和２，４－Ｄ［１７］。而酸性磷酸酶生物传感器依据有些农药能可逆地抑制酸性磷酸酶（ＡＰ）。将ＡＰ和葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）偶联到商品Ｈ２Ｏ２感测电极上，可开发出一种双酶生物传感器［１８］，用于电化学检测马拉硫磷、甲基对硫磷和对氧磷。有机磷和氨基甲酸酯类农药以及莠去津等各种不同化合物都能抑制酪氨酸酶。依据酪氨酸酶活性抑制作用原理制成的电化学生物传感器主要有电流［１９］和方波伏安（ＳＷＶ）［２０］两种类型。因为受到许多底物和抑制剂干扰，酪氨酸酶生物传感器特异性较差。

（四）过氧化物酶、谷胱甘肽巯基转移酶生物传感器

将辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）共价结合在金电极上，开发出一种基于过氧化物酶抑制原理的生物传感器［２１］，用130··