如何提高显微镜的分辨率
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B技术论文
如 何 提 高 显 微 镜 的胡
玉 华
分胡 玉 芝
辨陈 守 清
率
48
□Baidu Nhomakorabea
显 微 镜 是 实 验 室 最 重 要 的 设 备 之 一 ，而 评价光学显微镜及电子显微镜性能的重要 指标都是分辨率。
1 、显微镜的分辨率
分辨率是指能清楚地分辨两个小点或 两线间的最小距离。人眼本身就是一台显微 镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离（国 际 公 认 为 25cm） 上 的 分 辨 率 约 等 于 1/ 10mm。对于观察两条直线来说，由于直线 能 刺 激 一 系 列 神 经 细 胞 ，眼 睛 的 分 辨 率 还 能 提 高 一 些 ，这 就 是 显 微 镜 的 分 划 板 使 用 双 线 对准的原理所在。
D=0.61λ／N .A. 式中：D 为分辨率 （μm）；λ 为光源波 长（μm）； N .A 为物镜的数值口径（也称镜口率）。
2、光 学 、电 子 显 微 镜 分 辨 率 的 区 别及提高
（1）光 学 显 微 镜 与 电 子 显 微 镜 分 辨 率 的 区别
电 子 显 微 镜 是 显 微 光 学 一 次 革 命 ，它 使 显微光学的 最 小 分 辨 间 距 从 0.2um 提 高 到 0.2~0.3 纳米,使人类能够看到一排排原子阵 列 的 晶 格 结 构 ，从 而 极 大 地 提 高 了 人 类 研 究 微 观 世 界 的 能 力 ，而 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜最大分辨率不同的原理是所使用波长不 同 ，前 者 使 用 可 见 光 ，分 辨 率 最 高 达 0.1 微 米级，最高放大倍率只能到 1600 倍左右。后 者 使 用 电 子 ，根 据 物 质 波 波 长 理 论 ，在 几 十 千 伏 至 几 百 千 伏 的 电 压 加 速 下 ，可 使 电 子 显 微 镜 的 分 辨 率 达 到 纳 米 级 ，比 光 学 显 微 镜 的 分辨率高千倍。
●如何提高电子显微镜分辨率 电子显微镜就是利用短光波来提高分 辨力以检视较小物体的。物镜分辨力的高低 与造象是否清楚有密切的关系。而目镜没有 这种性能，因为目镜只放大物镜所造的象。 为 此 ，提 高 电 子 显 微 镜 放 大 率 的 方 法 可 从 以 下几个方面考虑：①保持良好的加速电压。 加速电压不能很低，正常应保持在 20~30KV。②尽量缩短工作距离。工作距离不 能太大，一般保持在 5~8mm，以缩短探头接 收 信 号 的 距 离 。 ③ 保 持 好 样 品 的 倾 斜 度 ，样 品倾斜 10~150，使二次电子发射及接收的 多。 ④ 聚 光 镜 放 在 600~ 650 左 右 ，（数 值 越 大 ，束 斑 尺 寸 越 小 ，分 辨 率 越 高）。 ⑤ 对 中 良 好 ，保 证 电 子 束 对 中 ，信 号 强 ，亮 度 好 。 ⑥ 及 时 更 换 新 的 灯 丝 ，使 灯 丝 饱 和 ，束 流 稳 定 ，并 使束流值保持在 100~150。⑦物镜光阑合轴 好（特征点在 2000X 倍以上时，基本 同 心 聚 焦 散 焦）。 ⑧ 延 长 抽 真 空 的 时 间 以 提 高 真 空 度（一般在 30 分钟以上基本达到平衡）或检 查真空系统的密封状态。（作者单位：建平县 产品质量监督检验所）
（2）提 高 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜 分 辨 率的方法
●提高光学显微镜分辨率的方法 根据分辨率的计算公式：D=0.61λ／N . A. ，可 知 提 高 光 学 显 微 镜 分 辨 率 的 方 法 有 三 种：①减低波长。可见光最短波长 0.39μm， 若用 0.13μm 的紫外线作光源，则会比普通 显微镜提高 3 倍以上。可是由于紫外线显微
镜 的 透 镜 材 料 需 特 殊 材 质（透 过 紫 外 线 的 材 料）制造，加之紫外线显微镜不能 用 肉 眼 直 接观察，只能通过摄制显微镜照片进行分 析 ，这 样 就 限 制 了 紫 外 线 显 微 镜 的 应 用 。 ② 增大折射率。一般显微镜的物镜分为低倍物 镜（2 × 、4 × 、10 × 等）、高 倍 物 镜（40 × 、45 × 等）、水浸物镜 （63×）、油浸物镜 （90×、 100 ×）等 。 低 倍 物 镜 也 叫 干 燥 系 物 镜 ，其 介 质是空气，折射率是 1；水浸物镜介质是蒸馏 水，其折射率为 1.33；油 浸 物 镜 介 质 是 香 柏 油或其它透明油，其折射率一般在 1.52 左 右 ，接 近 透 镜 和 载 玻 片 的 折 光 率 。 水 浸 物 镜 和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用 高 折 射 率 的 介 质 ，分 辨 率 也 高 。 ③ 加 大 物 镜 的镜口率来提高分辨力。数值孔径（镜口率） 公 式 为 ：N .A=n.sinα 式 中 ：n—物 镜 与 标 本 之 间 的 介 质 析 射 率 ；α — 物 镜 的 镜 口 角 。 如 低倍物镜指 1×~6×，NA 值为 0.04~0.15；中 倍 物 镜 指 6×~25× ，NA 值 为 0.15~0.40；高 倍物镜指 25×~63×，NA 值为 0.35~0.95；而 油 浸 物 镜 指 90 ×~100 × ，NA 值 可 达 1.25~1.40。由此可见，那 NA 值越大，说明显 微镜物镜的镜口率越大，D 值越小，分辨力 越高，物象越清楚。
人 眼 的 分 辨 率 只 有 1/ 10mm， 那 么 比 1/ 10mm 小的物体或比 1/ 10mm 近的两个微 小 物 体 的 距 离 ，人 眼 就 无 法 分 辨 了 。 这 时 人 们 开 始 研 制 出 放 大 镜 和 显 微 镜 ，显 微 镜 的 分 辨率定义是指在标本上能清楚分辨的两个 小点之间的最小距离。其计算公式为：
如 何 提 高 显 微 镜 的胡
玉 华
分胡 玉 芝
辨陈 守 清
率
48
□Baidu Nhomakorabea
显 微 镜 是 实 验 室 最 重 要 的 设 备 之 一 ，而 评价光学显微镜及电子显微镜性能的重要 指标都是分辨率。
1 、显微镜的分辨率
分辨率是指能清楚地分辨两个小点或 两线间的最小距离。人眼本身就是一台显微 镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离（国 际 公 认 为 25cm） 上 的 分 辨 率 约 等 于 1/ 10mm。对于观察两条直线来说，由于直线 能 刺 激 一 系 列 神 经 细 胞 ，眼 睛 的 分 辨 率 还 能 提 高 一 些 ，这 就 是 显 微 镜 的 分 划 板 使 用 双 线 对准的原理所在。
D=0.61λ／N .A. 式中：D 为分辨率 （μm）；λ 为光源波 长（μm）； N .A 为物镜的数值口径（也称镜口率）。
2、光 学 、电 子 显 微 镜 分 辨 率 的 区 别及提高
（1）光 学 显 微 镜 与 电 子 显 微 镜 分 辨 率 的 区别
电 子 显 微 镜 是 显 微 光 学 一 次 革 命 ，它 使 显微光学的 最 小 分 辨 间 距 从 0.2um 提 高 到 0.2~0.3 纳米,使人类能够看到一排排原子阵 列 的 晶 格 结 构 ，从 而 极 大 地 提 高 了 人 类 研 究 微 观 世 界 的 能 力 ，而 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜最大分辨率不同的原理是所使用波长不 同 ，前 者 使 用 可 见 光 ，分 辨 率 最 高 达 0.1 微 米级，最高放大倍率只能到 1600 倍左右。后 者 使 用 电 子 ，根 据 物 质 波 波 长 理 论 ，在 几 十 千 伏 至 几 百 千 伏 的 电 压 加 速 下 ，可 使 电 子 显 微 镜 的 分 辨 率 达 到 纳 米 级 ，比 光 学 显 微 镜 的 分辨率高千倍。
●如何提高电子显微镜分辨率 电子显微镜就是利用短光波来提高分 辨力以检视较小物体的。物镜分辨力的高低 与造象是否清楚有密切的关系。而目镜没有 这种性能，因为目镜只放大物镜所造的象。 为 此 ，提 高 电 子 显 微 镜 放 大 率 的 方 法 可 从 以 下几个方面考虑：①保持良好的加速电压。 加速电压不能很低，正常应保持在 20~30KV。②尽量缩短工作距离。工作距离不 能太大，一般保持在 5~8mm，以缩短探头接 收 信 号 的 距 离 。 ③ 保 持 好 样 品 的 倾 斜 度 ，样 品倾斜 10~150，使二次电子发射及接收的 多。 ④ 聚 光 镜 放 在 600~ 650 左 右 ，（数 值 越 大 ，束 斑 尺 寸 越 小 ，分 辨 率 越 高）。 ⑤ 对 中 良 好 ，保 证 电 子 束 对 中 ，信 号 强 ，亮 度 好 。 ⑥ 及 时 更 换 新 的 灯 丝 ，使 灯 丝 饱 和 ，束 流 稳 定 ，并 使束流值保持在 100~150。⑦物镜光阑合轴 好（特征点在 2000X 倍以上时，基本 同 心 聚 焦 散 焦）。 ⑧ 延 长 抽 真 空 的 时 间 以 提 高 真 空 度（一般在 30 分钟以上基本达到平衡）或检 查真空系统的密封状态。（作者单位：建平县 产品质量监督检验所）
（2）提 高 光 学 显 微 镜 和 电 子 显 微 镜 分 辨 率的方法
●提高光学显微镜分辨率的方法 根据分辨率的计算公式：D=0.61λ／N . A. ，可 知 提 高 光 学 显 微 镜 分 辨 率 的 方 法 有 三 种：①减低波长。可见光最短波长 0.39μm， 若用 0.13μm 的紫外线作光源，则会比普通 显微镜提高 3 倍以上。可是由于紫外线显微
镜 的 透 镜 材 料 需 特 殊 材 质（透 过 紫 外 线 的 材 料）制造，加之紫外线显微镜不能 用 肉 眼 直 接观察，只能通过摄制显微镜照片进行分 析 ，这 样 就 限 制 了 紫 外 线 显 微 镜 的 应 用 。 ② 增大折射率。一般显微镜的物镜分为低倍物 镜（2 × 、4 × 、10 × 等）、高 倍 物 镜（40 × 、45 × 等）、水浸物镜 （63×）、油浸物镜 （90×、 100 ×）等 。 低 倍 物 镜 也 叫 干 燥 系 物 镜 ，其 介 质是空气，折射率是 1；水浸物镜介质是蒸馏 水，其折射率为 1.33；油 浸 物 镜 介 质 是 香 柏 油或其它透明油，其折射率一般在 1.52 左 右 ，接 近 透 镜 和 载 玻 片 的 折 光 率 。 水 浸 物 镜 和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用 高 折 射 率 的 介 质 ，分 辨 率 也 高 。 ③ 加 大 物 镜 的镜口率来提高分辨力。数值孔径（镜口率） 公 式 为 ：N .A=n.sinα 式 中 ：n—物 镜 与 标 本 之 间 的 介 质 析 射 率 ；α — 物 镜 的 镜 口 角 。 如 低倍物镜指 1×~6×，NA 值为 0.04~0.15；中 倍 物 镜 指 6×~25× ，NA 值 为 0.15~0.40；高 倍物镜指 25×~63×，NA 值为 0.35~0.95；而 油 浸 物 镜 指 90 ×~100 × ，NA 值 可 达 1.25~1.40。由此可见，那 NA 值越大，说明显 微镜物镜的镜口率越大，D 值越小，分辨力 越高，物象越清楚。
人 眼 的 分 辨 率 只 有 1/ 10mm， 那 么 比 1/ 10mm 小的物体或比 1/ 10mm 近的两个微 小 物 体 的 距 离 ，人 眼 就 无 法 分 辨 了 。 这 时 人 们 开 始 研 制 出 放 大 镜 和 显 微 镜 ，显 微 镜 的 分 辨率定义是指在标本上能清楚分辨的两个 小点之间的最小距离。其计算公式为：