蛋鸡场所涉及ELLISA检测项目调查报告

蛋鸡场所涉及检测项目调查报告2015-6-26 技术部刘培辰摘要：通过咨询疫控中心、禽流行病研究人员、查找相关文献，对蛋鸡场所涉及的检测项目（主要是病毒性疾病）及其研究进展进行调查，以期对生产研发有一定指导意义。

关键词：禽流感；新城疫；禽白血病；马立克氏病；检测技术。

一、疫控中心所涉及检测项目一般的蛋鸡场并不设立实验室，疾病检测一般由各级疫控中心抽验检测，检测项目只有新城疫和禽流感；饲料检测一般由药检所针对饲料厂进行检测。

二、蛋鸡重要疾病09年度蛋鸡产业技术报告指出：在蛋鸡疾病快速检测技术方面建立了鸡白血病、鸡贫血病毒、网状内皮增生症、马立克氏病等PCR检测方法；在种源性疾病净化技术方面对鸡白痢、禽白血、支原体等形成技术方案；建立了传染性支气管炎和禽流感病毒基因信息库；在实验室进行了禽流感和新城疫的免疫保护临界值试验。

（PS：09年制定首个地方洁蛋标准，制定了鸡蛋中药物残留以及三聚氰胺检测标准）。

有文章（王明玉2013）指出，对蛋禽养殖业破坏力巨大的疾病多在冬季发生，主要是病毒性疾病和呼吸系统疾病。

病毒病以新城疫、禽流感最多，呼吸道疾病以支原体与其它病毒病（传支、传喉、新城疫）的混合感染为主。

也有文章对蛋鸡群的主要传染病进行了免疫监督（李永明2004），结果为鸡白痢隐性感染率为0%-19.3%，新城疫和禽流感抗体水平较高，减蛋综合征的免疫效果较差；并分析其与健康状况的关系。

卞红春（2013）等人对盐城市蛋鸡传染病流行病学调查表明：该地区鸡H5亚型禽流感、新城疫、传染性法氏囊、减蛋综合征等重大疫病得到控制；呼吸道疾病（支原体、大肠杆菌、肾型传支）仍有一定发病率；免疫抑制类疾病（马立克氏病、淋巴白血病、网状内皮增生症、传染性腺胃炎等）发病率呈上升趋势。

另哈尔滨兽医研究所官网的科研进展栏目有文章称哈兽研研制成功禽免疫抑制病系列诊断试剂盒。

禽免疫抑制病包括鸡传染性法氏囊病、禽白血病、马立克氏病、网状内皮增生症等。

另有某网站（****）挂出其所出售试剂盒有如下产品综上所述，现如今影响蛋鸡场的主要蛋鸡疾病为（按重要程度）：禽流感（H5、H7、H9）、新城疫、禽白血病、马立克氏病、减蛋综合征、鸡白痢、网状内皮增生症、传染性法氏囊、禽败血支原体病、传染性喉气管病、禽呼肠孤病等。

以下就几种重要的疾病从流行病学和检测技术方面做简要描述：2.1 禽流感流行病学高致病性禽流感主要病毒亚型为H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4和H7N7。

其中HPAI的主要特征是突然死亡和高死亡率，可以导致感染禽类的大量死亡。

对人类健康有潜在危险。

（参考黄俊姿2015）检测技术a病毒的分离鉴定准确度高，但是程序繁琐，耗时费力，临床一般不采用；b 琼脂扩散实验简单易行，可定性定量，但敏感度、准确性较低，易出现假阳；c 神经氨酸酶抑制试验（NIT）主要用于禽流感病毒亚型鉴定；d 酶联免疫吸附试验具有特异、快速、敏感、微量的特点，常用于大批样品和血清学检疫（目前哈兽研已建立了一系列ELISA方法，如禽流感病毒重组核蛋白ELISA 诊断技术、禽流感间接ELISA 诊断试剂盒、禽流感Dot-ELISA方法等）；e病毒中和试验敏感性、特异性、检出率相当高，但操作繁琐、费时耗力，这个方法常被当做标准；f 血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验是诊断和检疫中最常用的方法之一，不过禽血清中的一些非特异性血凝抑制因子常会造成一定数量的假阳性（可通过灭活和高碘酸钠去除非特异影响）；g分子生物学检测我国最新建立的禽流感病毒荧光RT-PCR 诊断试剂盒已获得新兽药证书。

2.2 新城疫流行病学新城疫是由新城疫病毒（一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒）引起的。

我国将其列为一类动物疫病，为防制重点，据农业部估计，中国每年因各种禽病造成的经济损失高达数十亿元，其中ND占了近10%。

刘浩（2014）按照RT-PCR检测陕西省未发病鸡群19960份血清，阳性率为2.98%，表明鸡群有新城疫病毒隐性感染，有发生疫情的潜在风险。

检测技术①免疫分析方法包括免疫传感技术、蛋白质芯片技术、胶体金免疫层析法、单克隆抗体技术、琼脂凝胶扩散试验、免疫组化技术、免疫荧光技术、乳胶凝集试验，以及ELISA、HA和HI、SNT、NIT、RIA等；②分子生物学检测方法包括多重RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR、环介导逆转录等温扩增技术、基因芯片、液相芯片技术、RNA指纹图谱、核酸探针技术等。

免疫分析方法有敏感性好、特异性强、可重复使用、抗原用量少等优点，但抗原抗体制备过程复杂、要求纯度高、酶结合物的特异性等问题有待解决；分子生物学技术难以普及和应用；生物芯片技术具有高通量、高灵敏度、自动化的优点，更直观的检测病毒核酸的存在，是临床检测的一个重要发展方向。

（参考杜景姣2012）2.3 禽白血流行病学禽白血病是由ALV 引起的以造血细胞增生为主的一类肿瘤疾病。

1988年，J亚群禽白血病在世界范围内发生，造成巨大经济损失。

在我国广泛存在，近几年流行日趋严重。

2009年高玉龙等人对我国8个省区178份禽白血病料样品通过PCR方法检测，结果显示检出ALV-J 69.7%、ALV-A 13.9%、ALV-B 3.9%。

表明我国目前ALV的感染以J亚群为主，A、B亚群同时存在。

目前由于对禽白血病没有有效的疫苗和药物进行防治，各国控制该病的主要手段是通过对鸡群进行ALV的检测，淘汰带毒的种鸡，通过不断的净化达到纯化种群的目的检测技术①病毒分离与鉴定②血清学检测包括病毒中和试验（NT）、琼脂扩散试验、免疫荧光检测（IFA）、ELISA法，其中只有ELISA法应用广泛，特异性强、重复性好、耗时短，是有效普检方法，定期对种禽群进行ALV的检测与净化。

此法在临床上有一定的假阳性率出现。

但在中小型养殖场由于其价格昂贵而很少应用。

ALV-J的ELISA检测时应用针对ALV-J核心蛋白P27/病毒囊膜蛋白gp85的ELISA诊断技术。

③分子生物学检测包括普通PCR、RT-PCR、实时定量PCR。

PCR方法可进行早期诊断。

（张小桃2009）2.4 马立克氏病流行病学马立克氏病是由疱疹病毒引起的一种淋巴细胞增生性、高度接触性传染病。

MD广泛存在于世界上几乎所有养禽的国家，其危害程度随着养禽规模的增大而增大，与新城疫、传染性支气管炎一起被公认为养鸡业的三大传染病。

其毒力和致病性在不断的演化之中，难以通过传统疫苗控制。

MDV具有免疫抑制作用，使机体更易感其他种病原侵袭。

（徐慧2006）检测技术常用的检测方法包括：病理组织学检查、琼脂免疫扩散实验、血凝抑制试验、PCR诊断技术、核酸探针、免疫组织化学方法。

（龚振华2012）张丽娟等人（2014）根据马立克氏病Meq基因序列特点设计了一对引物，与其他4对已发表的检测引物进行特异性和敏感性的比较，其Meq5引物在特异性相同的情况下，敏感性更优。

未见ELISA在马立克氏病检测上的应用。

2.5 减蛋综合征王爱华等人（2005）用15nm的胶体金颗粒作为标记物制备了鸡减蛋综合征病毒胶体金试纸条，检测135份样本与HA方法比较，结果显示阳性符合率89.8%，并与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。

2.6鸡白痢鸡白痢是由白痢沙门氏菌引起的以排白色粪便为特征的急性败血性传染病。

检测方法①血清学方法包括全血玻板凝集试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验等。

徐耀辉（2006）通过酶标单抗与鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种抗体阻断ELISA，较全血玻板凝集试验特异性好、灵敏度高。

②分子生物学技术。

2.7 传染性法氏囊流行病学是由传染性法氏囊病毒引发的高度接触性传染病，感染3-6周龄幼鸡，还可以引起免疫抑制。

检测方法常用的血清学检测方法主要有琼脂扩散试验和ELISA。

张华（2014）用大肠杆菌原核表达纯化制备了IBDV VP2重组抗原，并以IBDV VP2上半段重组抗原作为包被抗原建立了用于检测鸡IBDV血清抗体的间接ELISA方法。

另有陈志飞（2009）建立了鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法。

2.8 其他禽网状内皮组织增生症蒋艳萍（2012）等人研制成功禽网状内皮组织增生症（RE）抗体检测试剂盒。

整体来说，ELISA种类非常多，已建立的用于REV 检测的ELISA方法有：间接ELISA、ABC-ELISA、改良阻断ELISA和单抗俘获ELISA 等方法。

（庄金秋2014）鸡传染性喉气管炎何来（2007）针对传染性喉气管炎病毒gD、gE、gJ 基因的表达，尝试建立间接ELISA方法，最终选择r-gD为ILTV野毒感染鸡的血清抗体检测ELISA抗原，并确立了间接ELISA方法。

郭建友（2014）以高亲和Ni-NTA 层析树脂纯化重组杆状病毒表达的gD蛋白,建立了检测ILTV抗体的间接ELISA方法，此法与BioChek公司商品化试剂盒相比符合率为93.02%,与新城疫、H9亚型禽流感和传染性支气管炎阳性血清均无交叉反应。

禽败血支原体可引起鸡群感染慢性呼吸道传染病，病程长，发病率高，造成蛋鸡产蛋下降，被世界卫生组织列为B类传染病。

吕粤等人（2012）通过用爱德士鸡败血支原体抗体检测试剂盒对云南省12个地州市共1245份样本进行检测，阳性率达40%，提示MG已成为云南养禽业的重大隐患。

王涛等人（2009）通过爱德士鸡败血支原体抗体检测试剂盒对新疆地区各地848份样品检测结果为阳性率55.9%，表明该病在新疆广泛存在。

禽呼肠孤病由呼肠孤病毒引起，该病毒为呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒成员，双链RNA。

主要检测方法有免疫琼脂扩散试验、乳胶凝集试验、ELISA、免疫印迹间接免疫过氧化物酶试验、PCR方法、核酸探针技术等。

其中ELISA方法具有特异性、敏感性高的特点，有学者把能诱导中和抗体产生的sigma C和sigma B 蛋白作为包被抗原建立了sigma C-sigma B ELISA方法，比传统ELISA精确度高，与中和试验的符合率可以达到100%。

（刘红等，2008）小结：蛋鸡场特异的检测项目主要以危害蛋鸡生产的禽病检测为主，目的为给蛋鸡生产提供可靠依据，降低风险。

其中禽流感（H5、H7、H9）、新城疫、禽白血病、马立克氏病（暂未查到可用ELISA检测）、减蛋综合征为重中之重，鸡白痢、网状内皮增生症、传染性法氏囊、禽败血支原体病、传染性喉气管病、禽呼肠孤病等也对蛋鸡生产有较大影响，可进一步调查其研发生产可行性。

为使产品研发更贴近蛋鸡生产实际需要，试剂盒研发生产项目的实用性需近一步核实与商榷。