第25章临床酶法分析原理与方法

当反应达到平衡，假设 ，即 [S0]－[St] ≈ [S0]，则 可简化为：
Km [S0]
t = 4.606
+
V max V max
说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax和[S0]有关，
Km越小、Vmax越大、[S0]越小则达到平衡所需的时 间越短。
若 [S0] <<Km，公式25-1式简化为：
v = Vmax[S] = K[S]
Km
如同时检测标准管，则有：
标准管v 标准管[S]
测 定管v = 测 定管[S]
公式25-4
标准管的[S0]与测定管的[S0]分别表示为Cs和Cu，速 度用△ A/min来表示。上式改写为：
标准管ΔΑ / min Cs
测 定管ΔΑ / min = Cu
公式25-5
将米氏方程改写为：
d [S] Vmax[S] v = dt = Km+[S]
-d[S] (Km + [S])
V max[S]
= dt
-d[S]
(
V
Km
max[S]
+
V
1 max
)
=
dt
公式25-1
积分得：
Km [S0] [S0]-[St] t = 2.303 V max lg [St] + V max
d [S]Km V max [S] = dt
积分得：
t
=
2.303
Km V max
lg
[S0] [St]
如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度， 只要标准管与测定管的反应时间（t）一致，则有：
lg
标准管[S0] 标准管[St]
=lg
测 测
定管[S0] 定管 [St ]
标准管[S0] 标准管[St]
第一节 酶法分析方法的理论基础
酶法分析是以酶为试剂测定酶促反应的底物、 辅酶、辅基、激活剂、抑制剂以及酶偶联法测 定酶活性等的一类方法。
临床酶法分析是指用酶法分析的方法来测定人 体內的代谢物或代谢产物的技术。
酶法分析的优点
优点
1
由于酶作用的特异性高，成份复杂的血清等体液 样品不需进行预处理就能测定，简化了实验程序
临床酶法分析的原理与方法
教学目标与要求
掌` 握
临床酶法分析的概念，脱氢酶和过氧化 物酶指示系统的应用原理。
熟`悉 了`解
临床酶法分析的理论基础，酶循环法以 及其它酶法分析的设计原理。
临床酶法分析的发展前景。
主要内容
酶法分析方法的理论基础
酶反应前后光吸收变化测定的与原理与方法
脱氢酶指示系统测定的原理与方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 酶循环测定的原理与方法 酶激活与酶抑制测定的原理与方法
公式25-5就是速率法测定代谢物浓度的原理，其 前提条件是测定酶促反应的初速度。随着酶促反 应的进行，[S]越来越小，v也越来越小。
平衡法与速率法这两种方法是相互联系的，平衡法 在开始的一段时间内有可能遵循一级反应规律。相 反，速率法只要给予足够的时间也会趋于平衡。对 于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对 于速率法来说关键是如何使酶促反应成为一级反应。
第二节 酶反应前后光吸收变化测定的原理和方法
有些待测物本身在一定波长下就具有特异性的光 吸收，但经过酶促反应以后生成的产物在相同的 波长处则无特异性的光吸收。通过直接测定待测 物或产物本身信号的改变即可进行定量，这种分 析方法即是酶反应前后光吸收变化测定法。
如尿酸在293 nm处有特异性的光吸收，但经过尿 酸氧化酶（UAO）催化生成的尿囊素则在293 nm 处无特异性光吸收，可以通过尿酸在293 nm处的 吸光度下降来计算尿酸的浓度。
=
测 测
定管[S0] 定管 [St ]
标准管[S0 测 定管[S0
] ]
=
标准管[St 测 定管[St
] ]
=
标准管[S0 测 定管[S0
-
St St
] ]
公式25-2
标准管的 [S0－St] 与待测管的 [S0－St] 分别代表消
耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光
度来表示（As和Au）。标准管的[S0]与测定管的[S0] 分别表示为Cs和Cu。
胆红素在450 nm处有特异性的光吸收，经胆红 素氧化酶（BOD）作用生成胆绿素，导致胆红 素在450 nm处的吸光度下降，以此来测定胆红 素的浓度。
胆红素
BOD O2
胆绿素
H2O
第三节 脱氢酶指示系统测定的原理和方法
• 脱氢酶可以催化底物脱氢，脱氢酶催化 的反应如下：
• 以脱氢酶为指示酶系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ （NAD+）或氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）在340 nm处的 吸光度增加来计算待测物的浓度，也可利用脱氢酶的 逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测 定340 nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度。
Cs As =
Cu Au
公式25-3
二、速率法测定的理论基础
速率法测定的是酶促反应的速度（通常是指初速度），
其依据是，当底物的消耗量较小时（<5%），酶促反 应呈一级反应，此时的酶促反应速度（v）与代测物的 浓度成正比例。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
根据米氏方程：
Vmax [S] v = Km+ [S]
①当[S] <<Km，则[S]+ Km ≈ Km，②当酶量固定不变 时，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时, 酶促反 应符合一级反应。
2
由于酶具有高催化效率，加快了反应速度，提髙 了工作效率
试剂酶的本质大多是蛋白质，酶促反应的条件温
3
和，没有毒性，避免了化学品对人体的危害和对
环境的污染
4
制成试剂盒即可以手工操作，又可以自动化分析
酶法分析根据检测类型可分为平衡法（终点法） 和速率法（动力学法）。
根据方法设计的原理不同分为：酶反应前后光吸 收变化测定法、脱氢酶指示系统测定法、过氧化 物酶指示系统测定法、酶循环测定法和酶激活与 酶抑制测定法等。
酶反应前 后光吸收 变化测定 法
脱氢酶指示 系统测定法
酶法分析
酶循环 测定法
酶激活与酶 抑制测定法
过氧化物 酶指示系 统测定法
一、平衡法测定的理论基础
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促 反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小 （<1%～5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定， 即通常所说的终点，所以又称为终点法。
NAD(P)+ ¬¾enz¾ym¾e®NAD(P)H
一、单酶反应测定法
• 有一些待测物测定的时候不需要偶联另一个酶 促反应，经一步反应后就可以完成氧化型辅酶 和还原性辅酶之间的转换，称为单酶反应法。
• 由于该类反应通过辅酶在氧化型与还原型之间 的转换进行，所以很容易用紫外吸收分光光度 法测定340nm处吸光度的增减来进行定量。例 如乳酸、丙酮酸的测定等。