流式细胞仪全面讲解

流式细胞仪入门

----- 秦华 译

目录

前言

第1章综述

第2章液流系统

第3章散射光信号及荧光信号

3.1 散射光信号

3.2 荧光信号

第4章光电系统

4.1 光平台

4.2 光学滤片

4.3 信号探测器

4.4 阀值

第5章数据分析

5.1 数据采集及显示

5.2 设门

5.3 细胞亚群的数据分析

5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选

6.1 分选

第7章激光器及光路校正

7.1 激光器的工作原理

7.2 光路校正

第8章习题答案

序论

学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。

本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

第一章综述

流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。

流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：

z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。

z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。

z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。

在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。

单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。

图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲

习题：综述

1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？

2 大多数流式细胞仪使用何种光源？

3 流式细胞仪的三大系统是什么？

4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？

5 液流包绕细胞形成？

6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？

7 由粒子激发的光由收集。

8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对错）

9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对错）

第二章液流系统

液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。

因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。

流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：

图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦

图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦

样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。

z台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交（图2-1）。除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。

z大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交（图2-2）。且样本压力连续可调。

增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。

z高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距

离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。

z低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。

为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。

习题：液流系统

1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？

2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？

3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？

4 单个细胞悬液在内注入。

5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为效应。

6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？

7 对于台式机，样本的固定压力是多少。

8 增加样本压力，也就是样本流速和液柱。

9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。

10 加大流速会降低检测分辨率。（对错）

11 定性检测时可使用高流速。（对错）