流式细胞仪全面讲解

流式细胞仪入门
----- 秦华 译
目录
前言
第1章综述
第2章液流系统
第3章散射光信号及荧光信号
3.1 散射光信号
3.2 荧光信号
第4章光电系统
4.1 光平台
4.2 光学滤片
4.3 信号探测器
4.4 阀值
第5章数据分析
5.1 数据采集及显示
5.2 设门
5.3 细胞亚群的数据分析
5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选
6.1 分选
第7章激光器及光路校正
7.1 激光器的工作原理
7.2 光路校正
第8章习题答案
序论
学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。

本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。

阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。

第一章综述
流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。

通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。

流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。

其作用如下：
z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。

z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。

z电系统：把光信号转换为电信号。

对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。

在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。

任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。

在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。

被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。

含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。

散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。

分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。

单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。

图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲
习题：综述
1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？
2 大多数流式细胞仪使用何种光源？
3 流式细胞仪的三大系统是什么？
4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？
5 液流包绕细胞形成？
6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？
7 由粒子激发的光由收集。

8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对错）
9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对错）
第二章液流系统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。

而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。

因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。

流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。

在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。

流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。

这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。

该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：
图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦
图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦
样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。

样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。

z台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内与激光相交（图2-1）。

除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。

z大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外与激光相交（图2-2）。

且样本压力连续可调。

增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。

换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。

当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。

z高流速适用于定性测量，如免疫表型。

样本流变宽，细胞间距
离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数据。

z低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。

为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。

习题：液流系统
1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？
2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？
3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？
4 单个细胞悬液在内注入。

5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为效应。

6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？
7 对于台式机，样本的固定压力是多少。

8 增加样本压力，也就是样本流速和液柱。

9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。

10 加大流速会降低检测分辨率。

（对错）
11 定性检测时可使用高流速。

（对错）
第三章散射光信号和荧光信号的检测
上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。

3.1 散射光信号
粒子折射激光产生散射光信号。

散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。

散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。

前向角散射：前向角散射（FSC）光与被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号（见图3-1）。

FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。

侧向角散射：侧向角散射（SSC）光与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见图3-1）。

SSC收集与激光束正交90度方向的散射光信号。

图3-1 细胞的光散射特性
上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数
组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。

图3-2 FSC、SSC二维散点图
习题：散射光信号
1 什么时候会发生光散射现象。

2 光散射信号与细胞的哪些特性有关。

3 与激光束方向相同的光散射称为散射。

4 FSC与细胞的哪些特性相关？
5 与激光束方向呈90度角的光散射称为散射。

6 SSC与细胞的和相关。

7 和双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。

3.2 荧光信号
荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。

然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。

这种能量的转换称为荧光。

能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。

因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。

荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。

目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm的激光器能够激发一种以上的荧光（详见第7章）。

光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。

FITC的激发光谱如图3-3所示， 488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。

图3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱
如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。

如FITC和PE双染就
符合这种条件。

这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。

虽然PE 的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。

更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。

他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。

被检测到的荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。

图3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱
图3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合
对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记确
认细胞类型（见图3-5）。

在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。

每个亚群的染色模式与FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。

而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。

习题：荧光信号
1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射。

2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为。

3 由荧光染料发射的波长称为。

4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。

5 能够激发FITC和PE的波长是多少。

6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是和。

7 荧光素标记抗体用于检测。

第四章 光学系统
光学系统由光学激发器和光学收集器组成。

光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。

光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。

光平台的设计可实现以上功能。

4.1 光平台
流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。

因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。

图4-1和图4-2分别为台式机 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平台系统。

图4-1 台式机 FACS Calibur 光平台系统
图4-2 台式机 BD LSR光平台系统
在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最佳角度和位置截取液流。

由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。

光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。

大型机的光平台系统见图4-3。

图4-3 大型机 FACS Vantage SE 光平台系统
习题：光平台
1 光平台为 的激光器提供了一个固定平面。

2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。

3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对 错）。

4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置
是不变的。

4.2 光学滤片
当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。

所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。

光电倍增管（PMTs）检测到的荧光信号常常是很微弱的。

在光电倍增管（PMTs）前设置滤片可以使相当窄的一波长范围内光通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的发射峰值。

这种滤片称为带通（BP）滤片。

如：FITC检测器前的滤片标志为530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者说允许通过的波长范围在515nm和545nm之间。

BP 500/50则表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。

流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片（LP）和短通滤片（SP），长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。

如LP500滤片，将允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。

短通滤片与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。

（见图4-4）。

分光器的主要作用是完成光的收发。

二色性反射镜就是其中一种。

560短通二色性反射镜如图4-1所示发射560nm或小于560nm的波长（如图4-1所示）。

大于560nm的波长被反射。

图 4-4 光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围
习题：光学滤片
1 检测器前放置滤片作用是什么。

2 带通滤片530/30发射的波长范围是到。

3 用于光的收发。

4 滤片允许特定波长及以下的光通过，而滤片
允许特定波长及以上的光通过。

4.3 光电探测器
处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压），然后到相应的通道。

BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。

光电倍增管（PMTs）对光信号比光电二极管敏感，所以前者用于检测较弱的SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强的FSC信号。

粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先光信号或光子由光电倍增管（PMTs）或光电二极管转换成相应的电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。

当粒子位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。

当粒子偏离激光束时，脉冲回到基线（如图4-5所示）。

图4-5 充电脉冲的产生
充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子数量，放大器可设置为线性放大或者对数放大（Lin或Log）。

对
数放大（Log）常常用于把阴性信号从微弱的阳性信号中分离出来；而线性放大（Lin）通常用于放大散射光信号和荧光信号。

充电脉冲通过模数转换器把0-1000mV的脉冲转换成为代表0-1,000mV通道的数值。

通道数值经由输入输出（GPIO）数据线传送到计算机进行处理显示（见图4-6）。

图4-6 模拟信号到数字信号的转换过程
习题：光电探测器
1 收集FSC光信号。

2 敏感度高的收集SSC光信号和荧光信号。

3 探测器产生电流，经由放大器转换成电压。

（对错）
4 模数转换器（ADC）的作用。

4.4 阀值
阀值用于设置低于该道值的信号不被处理，只有高于等于阀值道数的信号才会被送入计算机进行处理。

每次只能有一个设阀参数。

如：对免疫表型实验，阀值应设为FSC，以消除低于阀值道数的碎片。

用户可根据实验要求设置其它参数的阀值。

第二个阀值适用于配有两个激光器的台式机。

如果设置了两个阀值，那么粒子必须同时满足两个阀值的要求才会被当作信号细胞处理。

习题：阀值
1 FSC阀值用于消除信号。

2 如果设置两个阀值，细胞必须符合其中一个阀值的要求才会被
当作信号细胞处理。

（对错）
第五章数据分析
5.1 数据采集及显示
光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。

流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。

根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。

4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。

当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。

单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。

纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。

处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。

通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。

图5-1 流式数据分析图
双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。

3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。

习题：数据采集及显示
1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。

2 二维点图用于显示参数。

3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。

5.2 设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。

如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。

图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图
习题：设门
1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。

（对错）
5.3 细胞亚群的数据分析
数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。

如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。

如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。

图5-3 选定淋巴细胞亚群设门
门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。

在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。

我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。

单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。

如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。

直方图可直观单个参数的细胞数量。

阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。

左图中M1为阴性对照峰。

右图中M2为CD3 FITC阳性峰。

图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002）
图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。

其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。

淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。

图5-5 直方图统计结果
二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。

图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。

左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为
双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002)
如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。

图5-7 散点图统计结果
另一个分析方法是划定区域，也就是设门。

我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。

在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。

图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图
图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果
这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。

为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。

BD公司的MultiSET TM和Attractors TM软件就属于集群分析软件。

该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动
而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。

图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比
5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析
这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。

因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。

如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。

如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。

每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。

图5-11 单细胞株分析图
除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。

QuantiCALC TM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。

如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。

图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数
我们使用ModFit LT TM软件进行DNA定量分析。

因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的
面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

图5-13 细胞周期的DNA直方图
习题：数据分析
1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？
2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。

3 LL象限代表双阳性细胞亚群。

（对错）
4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。

5 只能使用矩形设定细胞区域范围。

（对错）
6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。

7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。

8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。

第六章分选
6.1 分选
在大多数应用中，粒子处理完毕都被送往废液缸，分选功能的实现使我们可以获取收集感兴趣的细胞以进行再分析。

除了大型机，部分台式机也有此功能。

要分选细胞，首先要识别待分选的细胞亚群。

我们需要在该亚群周围设定一逻辑门，也就是所谓的分选门。

不同的流式细胞仪分选方法不同。

比如台式机FACSCalibur 使用机械装置捕集管分选细胞。

捕集管位于流动的细胞上部，通过出入样本流的方法收集感兴趣的细胞亚群，分选速度为每秒300个细胞。

当细胞流过激光束时，FACSCalibur电系统通过设置好的分选门，快速确定分选目标。

因为激光光路和液流速度是固定的，细胞从光斑流向捕集管的时间也是恒定的。

当到达延迟时间时，捕集管转时样本流捕获细胞。

如图6-1所示，左图为捕集器位于鞘液流，右图为捕集器位于样本流，正在捕获目标细胞。

大型机FACSVantage SE通过振动整个液流的方法分离细胞。

由喷嘴射出的液柱沿轴线振动，断裂成距离相等的液滴。

当鞘液速率和喷嘴振动速度恒定时，液滴间的距离是固定的。

FACSVantage SE通过精确地计算液滴间的距离来实现细胞分选。

细胞的性质是在进入液滴以前已经被测定了的。

如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷。

这样，当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细胞形成的细
图6-1 （左）捕集器位于鞘液流；（右）捕集器位于样本流
图6-2 FACSVantage SE分选元件图
胞液滴及不包含细胞的空白液滴不被充电，也不带电荷。

带有电。