乳酸发酵实验

米根霉发酵生产L-乳酸

1 前言

乳酸是一种天然有机化合物，它广泛地应用在食品、化工、医药品中，是一种重要的原料。乳酸可分为L-乳酸和D-乳酸两种类型，人体不能过多的摄入D-乳酸，过多的摄入会使新陈代谢发生紊乱。L-乳酸的聚合物是一种可降解的、具有良好韧性的新型材料，其原料为可再生资源。因此L-乳酸已近被认为最具发展潜力的材料。目前已经在社会上各个领域得到广泛的应用。

目前社会工业上最主要生产的是L-乳酸，而且大都采用米根霉发酵法生产L-乳酸，这种方法具有操作简单、原料便宜、产物纯度高、菌种易于培养等优点。但由于技术不够高使其也有缺点，如生产的周期长、糖的转化效率太低、菌种易于结成团。抑制了工业上的应用，因此必须解决上述问题，才能使米根霉发酵法生产L-乳酸在工业上得到广泛的应用。

2 目的

本实验的目的主要是认识米根霉发酵法生产L-乳酸的过程，掌握米根霉发酵产L-乳酸的方法，使学生对米根霉发酵法生产L-乳酸有感性的认识，并掌握葡萄糖及乳酸的化学测定方法。

3 原理

葡萄糖进入细胞内后，在细胞液中通过EMP途径被分解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下直接脱氢形成目标产物—L-乳酸，其反应式如下：

2C6H12O6→3C3H6O3 + C2H5OH + CO2

4 实验材料

4.1 菌种

本实验所使用的菌种为米根霉(Rhizopus oryzae)。

4.2 使用的主要试剂与仪器

实验试剂

试剂名称规格

葡萄糖分析纯

木糖分析纯

琼脂粉生化试剂

硫酸铵分析纯

3,5一二硝基水杨酸分析纯

七水合硫酸锌分析纯

碳酸钙分析纯

钙羧酸分析纯

磷酸二氢钾分析纯

结晶酚分析纯

氯化钠分析纯

氢氧化钠分析纯

乙二胺四乙酸二钠分析纯

无水亚硫酸钠分析纯

盐酸分析纯

酒石酸钾钠分析纯

实验仪器

名称

SW-CJ-2F型超净工作台

SHP-160D型智能低温生化培养箱

HYG-B全温度摇瓶柜

TU-1810紫外可见分光光度计

LDZX-50KBS立体压力蒸汽灭菌器

JZC-TSC电子计重天平

CP114型电子天平

DHG-9101-OS型电热恒温鼓风干燥箱

HH-S恒温水浴锅

BCD-209KHA型冰箱

3L发酵罐

5 培养基

5.1 菌种斜面保藏培养基

取新鲜的马铃薯，去皮以后称取200 g切成小块，加入1000 mL水，煮沸20 min以后(能用玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤，在滤液中加入20 g琼脂粉和20 g葡萄糖，然后加热融化并补

足失水至1000 mL。放置于高压蒸汽灭菌锅中121℃下灭菌15 min后，将其倒入三角瓶中冷却制成斜面培养基。

5.2 种子与发酵培养基(g/L)

(1) 葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO4 4 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO4·7H2O 0.44 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L，CaCO3 40 g/L，pH值自然，以上培养基皆于121℃灭菌15 min。种子培养基葡萄糖为40 g/L。

6 检测方法

6.1 EDTA法测定发酵液中乳酸的含量

（1）溶液的配制

(1) 0.05 mol/L EDTA溶液：准确称取18.612 g的EDTA，加水溶解以后定容至1000 ml。

(2) 钙指示剂：称取1 g钙羧酸和100 g的氯化钠，使两者充分混合后，保存在棕色瓶中备用。

（2）实验方法

取l mL发酵液(V1)加入到盛有100 mL蒸馏水的三角瓶中，然后加入10 ml1 mol/L的NaOH 溶液与少量钙指示剂，用0.05 mol/L EDTA溶液滴定。溶液由紫红色变为纯蓝色即为滴定终点，消耗EDTA溶液的体积记为V2。

（3）结果计算

L-乳酸的含量(g/L)=(90.08×0.1×V1)/V2

V1:滴定到终点时消耗的EDTA溶液体积(ml)

V2:X吸取的发酵液体积(通常为1 ml)

6.2 DNS法发测定酵液中残糖含量

由于单糖含有游离的酮基或醛基，具有还原性，因此单糖属于还原糖。而蔗糖和多糖等，由于不含游离的醛基或酮基，因而他们属于非还原性糖。多糖能够被水解为单糖，此时可以通过测定水解后单糖的含量来测定原来总糖的含量。发酵液中残糖的测定方法主要有菲林试剂法、高效液相色谱法和DNS法。本实验主要采用DNS法来测定发酵液中残糖的含量。（1）溶液的配制

DNS显色剂：准确称取酒石酸钾钠182 g、重蒸馏酚4 g、无水亚硫酸钠3 g、氢氧化钠20 g，3,5－二硝基水杨酸6.3 g，加水溶解以后定溶到1000 ml。将配置好的溶液倒入棕色试剂瓶中保存备用。

1%葡萄糖标准溶液：准确称取100 mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至1000 ml。

（2）标准曲线的绘制

取9只试管，编号为1～9。分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL的1%葡萄糖标准溶液于8只试管中，加入1 ml的蒸馏水，然后分别加入DNS试剂1.5 mL。将各试管中的溶液混合均匀，放置于水浴锅中100℃加热5 min，取出后立即用流动冷水冷却至室温，再向各试管中加入21.5 ml蒸馏水，混合均匀。在540 nm光波波长下，用1号试管内的溶液调零，分别测量2～8号试管内溶液的吸光度值，其添加量如表2.1所示。

表2-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量

以葡萄糖毫克数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线(图2-1)。

图2-1 还原糖的标准曲线

由上图可知标准曲线公式：y=0.9438x+0.0179 R2=0.9992

（3）发酵液中残糖的测定