药典2005版--高效液相色谱测含量
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药典2005版
高效液相色谱法
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品由流动相带入柱内,各成分在柱内被分离,并依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
1.对仪器的一般要求
所用的仪器为高效液相色谱仪,仪器应定期检定并符合相关规定。
(1)色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。
离子交换填充剂用于离子交换色谱;凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等;手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充剂,直接影响待测物的保留行为和分离效果,孔径在15nm以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合物,分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂使用pH=2~8的流动相。
当pH>8时,可使载体硅胶溶解;当pH<2时,与硅胶相连的化学建和相易水解脱落。
当色谱系统中需使用pH>8的流动相时,应选择耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖率的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH<2的流动相时,应选择耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。
(2)检测器最常用的检测器为紫外检测器,其它常见的检测器有二极管阵列检测器(DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与待测溶液的浓度有光,还与化合物的结构有关;示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器,对所有化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与待测物的质量有关;二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱,故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器响应值与待测物的浓度通常不呈线性关系,必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同检测器对流动相的要求不同。
如采用紫外检测器,所用的流动相应至少符合紫外-可见分光光度法项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。
蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。
(3)流动相由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常不低于50%,否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定。
各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。
但对某些品种,必须用特定牌号的填充剂方能满足分离要求者,可在该品种项下注明。
2.系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。
其中,分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求;如达不到要求,可对色谱分离条件作适当的调整。
(1) 色谱柱的理论板数(n) 在规定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R(以分钟或长度计,下同,但应取相同单位)和半峰高宽(W h/2),按n=5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数。
(2) 分离度(R)无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
分离度的计算公式为:
式中t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间;
t R1为相邻两峰中前一峰的保留时间;
W1及W2为此相邻两峰的峰宽。
除另外有规定外,定量分析时分离度应大于1.5。
(3) 重复性取各品种项下的对照溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。
也可按各品种校正因子测定项下,配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别进样2次,计算平均校正因子,其相对标准偏差也应不大于2.0%。
(4) 拖尾因子(T)为保证分离效果和测量精度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。
拖尾因子计算公式为:
式中W0.05h为0.05峰高处的峰宽;
d1为峰极大至峰前沿之间的距离。
除另有规定外,峰高法定量时T应在0.95~1.05之间。
峰面积法测定时,T值偏离过大,也会影响小峰的检测和定量的准确度。
3.测定法
(1) 内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和内标物质,分别配成溶液,精密量取各溶液,配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量注入仪器,记录色谱图。
测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子:
式中A s为内标物质的峰面积或峰高;
A R为对照品的峰面积或峰高;
C s为内标物质的浓度;
C R为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液,注入仪器,记录色谱图,测量供试品中待测成分(或其杂质)和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量:
式中A x为供试品(或其杂质)峰面积或峰高;
C x为供试品(或其杂质)的浓度;
A s’内为内标物质的峰面积或峰高;
Cs’内为内标物质的浓度;
f为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液,使用同一浓度的内标物质溶液时,C s=C s’内则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。
(2) 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定量,注入仪器,记录色谱图,测量对照品和供试品待测成分的峰面积(或峰高),按下式计算含量:
式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法测定供试品中某杂质
或主成分含量时,以定量或或自动进样器进样为好。
(3) 加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时,可采用加校正因子的主成分自身对照法。
在建立方法时,按各品种项下的规定,精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,进样,记录色谱图,按上述(1)法计算杂质的校正因子。
此校正因子可直接载入各品
种正文中,用于校正杂质的实测峰面积。
这些需作校正计算的杂质,通常以主成分为参照采用相对保留时间定位,其数值一并载入各品种项下。
测定杂质含量时,按各品种项下规定的杂质限度,将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液,进样,调节仪器灵敏度(以噪音水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限),使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质,峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%;含量在0.5%~2%的杂质,峰面积的RSD应小于2%]。
然后,取供试品溶液和对照品溶液适量,分别进样,供试品溶液的记录时间除另有规定外,应为主成分保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。
(4) 不加校正因子的主成分自身对照法
当没有杂质对照品时,也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。
同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间除另有规定外,应为主成分保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。
若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离,则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ,再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。
色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积(包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积,即为总杂质峰的校正面积。
然后依法计算。
(5) 面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大,因此,本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。
除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查。
方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率。
卵磷脂PC含量的测定
色谱条件与系统适用性试验:用硅胶为填充剂,以异丙醇-正己烷-水(4:0.25:1)为流动相,流速0.7ml/min,检测波长为206nm,理论板数按多烯磷脂酰胆碱峰计算应不低于800,分离度应符合规定。
标准曲线的制备:精密称取多烯磷脂酰胆碱混合对照品各约80mg、120mg、150mg、180mg、200mg和250mg,分别置于10ml量瓶中,加正己烷-异丙醇(2:1)混合溶剂溶解并稀释至
刻度,摇匀,作为对照品溶液。
精密两取上述六种对照品各10μl注入液相色谱仪,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标计算回归方程。
供试品溶液的制备:取本品约500mg,精密称定,置100ml量瓶中,加正己烷-异丙醇(2:1)混合溶剂溶解并稀释至刻度。
测定法:精密量取供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,由回归方程计算多烯磷脂酰胆碱的含量。
20mg标样溶于10ml溶剂,然后分别吸取0.1ml, 0.2ml, 0.4ml, 0.8ml, 1.0 ml置于10ml容量瓶,然后用溶剂定容至刻度线。