利用原生质体融合和诱变育种技术选育高酶活菌株_张文学
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DO I :10.15961/j .jsuese .2003.06.016
第 35 卷 第 6 期 2003 年 11 月
四 川 大 学 学 报 (工 程 科 学 版 )
JOURNAL OF SICHUAN UN IVERSITY (ENGINEERING SCIENCE EDITION)
Vol .35 No .6 No v .2003
液体 深 层 发 酵培 养 基 :玉米 粉 5 %, 玉 米 浆 2 %, 黄豆粉 2 %, 麸皮 3 %, 柠檬酸调 pH 值 3 .5 左 右。 1 .1 .2 试剂
PBA 试 剂[ 1] , 渗 透 压 稳 定 剂[ 4] , 助 融 合 剂 PEG[ 1] 。
酶解 液 1[ 5] :1 g/L 纤 维 素 酶 , 1/ 15 mol/L K2HPO4 , 1/15 mol/ L KH2PO4 , 0 .6 mol/ L NaCl 。
1 实验部分
1 .1 实验材料 1 .1 .1 菌种及培养基
白曲霉基因工程菌 TR12 、黑曲霉 34309 由本实 验室保存 。
2 %YPD 培养基[ 2] ;淀粉培养基[ 2] ;X 培养基[ 2] ; 再生培养基[ 1] 。
液体深层发酵种子培养基 :玉米粉 6 %, 玉米浆 2 %, 黄豆粉 2 %, pH 自然 。
黑曲霉 34309 /(cell·ml -1)
4 .0 ×107 0 .9 ×107
酶和纤维素酶 、溶菌酶的混合酶液制得了两个亲 本的原 生质体 。 在 研究了 培养时 间 、培 养方法 、酶 解时间 、酶解 液
的配 比等条件对原生质体产量影响的基础上 , 以 PEG 诱导进行 了原生质 体的融合 , 并进 行了紫外 线照射 的诱变 育
种 。 通过比较在菌落外观 、颜色及形态上与白曲霉和黑曲 霉菌株的不同 , 以及进行 分离培养和 液态培养 摇瓶筛选 ,
耐酸性 α-淀粉酶活力 :采用修改的二硝基水 杨酸法[ 8] , 酶活力的定义为 , 在 40 ℃、pH =4 .35 每 分钟从可溶性淀粉中释放出 1 μmol 还原糖所需的酶 量。
糖化酶活力 :参照 DNS 试剂 法[ 8] , 酶活力的定 义为 , 在 50 ℃, pH =4 .5 每小时生成 1 mg 葡萄糖所
酶解液 2[ 5] :2 g/ L 纤维素酶 , 1 g/ L 溶菌酶 , 1/15 mol/ L K2HPO4 , 1/ 15 mol/ L KH2PO4 , 0 .6 mol/ L NaCl 。 1 .2 实验方法 1 .2 .1 菌种的扩大培养
挑取适量白曲霉 TR12 和黑曲霉 34309 的孢子 , 接种于 2 %YPD 固体培养基斜面上 , 放置在 32 ℃的 培养箱中培养 3 ～ 4 d , 使其生长成为带有孢子的成 熟菌体 , 4 ℃保存备用 。 1 .2 .2 原生质体的制备
菌种分离 :选择在菌落外观 、颜色及形态上与出 发菌株有差异 、产孢子较多且长势较好的斜面分别 进行摇瓶培养 , 取适量发酵液点滴淀粉培养基平板 , 经透明圈试验初步筛选后 , 选出菌株进一步摇瓶培 养筛选 , 经多轮淘汰后选留的几株斜面制成孢子悬 浮液 , 分别涂布多个茄子瓶斜面 , 在 32 ℃培养 5 ～ 7 d 后 , 选取斜面生长情况稳定的菌株进行再次的生 产水平检测 。
再生率 =(B/ A)×100 %。 计算出再生率 。其中 , A 为长出的菌落数 ;B 为原生 质体总数 。 1 .2 .4 原生质体的融合[ 7]
将制备好的原生质体等量混合于大试管 , 加入 适量预热的 PEG 助融 , 振荡均匀后置 28 ℃处理 15 ～ 20 min ;将适量冷的 PBA 试剂(pH 7 .0)移入离心管 终止融合 , 低速离心机趁冷离心(1000 r/min , 5 min)、 洗涤一次 。 1 .2 .5 融合子的再生及诱变
获得了一株具有较高酶活力的新菌株 , 其耐酸性 α-淀粉酶活性和糖化酶活性分别达到 91.2 u/ ml 和 3216.2 u/ ml 的
水平 。
关键词 :原生质体融合 ;诱变育种 ;液态培养 ;筛选
中图分类号 :Q939.97
文献标识码 :A
Screening of Higher Enzyme Activity Strain with Protoplast Fusion and Mutagenisis
损 , 有利于原生质体的释放 。
表 2 物理因素对原生 质体数量的影响 Tab.2 Effect of physical condition on
the amount of protoplasts
菌株
进行机械破碎处理 不进行机械破碎处理
白曲霉 TR12 /(cell·ml -1)
7.8 ×107 2.1 ×107
本研究室基于我国在耐酸性 α-淀粉酶研究上 的不足以及我国白酒工业 、淀粉糖工业 、酒精等发酵 工业对耐酸性 α-淀粉酶实际需求 的增加 , 利用基 因工程技术获得了具有多拷贝耐酸性 α-淀粉酶和
第 6期
张文学 , 等 :利用原生质体融合和诱变育种技 术选育高酶活菌株
67
糖化酶融合基因的白曲霉 工程菌 TR12 菌株 , 在液 态 AP 培养基中培养 , 其产耐酸性 α-淀粉酶和糖化 酶能力较亲株提高 6 ～ 7 倍 , 但菌种的生长繁殖速度 较慢 , 培养周期较长[ 2 , 3] 。 因而 , 本研究拟利用以上 原生 质体融合技术的 优点 , 将 白曲霉工程菌 TR12 菌株与实验室保存的具有较快生长繁殖速度的黑曲 霉 34309 菌株融合 , 再加以诱变育种和筛选 , 分离出 既具有较高产酶活力 , 又能缩短培养周期的新菌株 类型 。
摇瓶筛选 :种子培养 :250 ml 的三角瓶装 50 ml 种子培养基 , 灭菌接种后 , 在 210 r/min 旋转摇床上 32 ℃培养 24 h 。发酵培养 :250 ml 的三角瓶装 30 ml 发 酵培养基灭菌 后 , 按10 %的接种 量接种 , 在210 r/min 旋转摇床上 32 ℃恒温培养 72 h , 测耐酸性 α淀粉酶 , 糖化酶的活力 。 1 .2 .7 酶活力的测定
68
四川大百度文库学报(工程科学版)
第 35 卷
需的酶量 。
2 结果与讨论
2 .1 原生质体的制备 2 .1 .1 影响原生质体产量的因素
实验中发现 , 培养时间 、培养方法 、机械破碎处 理 、酶解时间 、酶解液的配比 、酶解温度对原生质体 的产量均有很大影响 。 在培养时间上 , 见图 1 以 14 h 的菌丝体的酶解效果最佳 。其原因可能是由于 14 h 时 , 菌体生长达到对数生长期的高峰 , 菌丝体含量 较多 , 且幼龄菌细胞壁较薄 , 结构比较简单脆弱 , 容 易被玻棒和玻璃珠破坏 , 使酶解液的作用效果最好 。 随着培养时间的继续增长 , 壁生沉积色素等次生物 质 , 阻碍了酶解液的作用 , 使细胞壁难以解体释放出 原生质体 。
固体培养法[ 5] (玻璃纸法): 将斜面培养基的孢子制成悬液 , 均匀涂布于表 面覆盖有玻璃纸的 2 %YPD 平板上 , 在 32 ℃培养 14 h ;将玻璃 纸上菌丝体 进行酶解 , 后用 冰浴终止 酶 解 ;酶解液用无菌镜头纸过滤 , 滤液移入离心管在低 速离心机中离心 , 去除上清液 , 用少量 0 .6 mol/ L NaCl 洗涤离心后 , 加入少量 0 .6 mol/ L NaCl , 4 ℃保存 。 液体培养法 :
文章编号 :1009-3087(2003)06-0066-05
利用原生质体融合和诱变育种技术选育高酶活菌株
张文学 , 刘春莉 , 蒋 宏
(四川大学 食品科学与工程系 , 四川 成都 610065)
摘 要 :以白曲霉(Aspergillus kawachii)基因工程菌 TR12 和黑曲霉(Aspergillus niger)34309 为出发菌株 , 分别用纤维素
ZHANG Wen-xue , LIU Chun-li , JIANG Hong
(Dept .of Food Sci .and Eng., Si chuan Univ., Chengdu 610065 , China)
Abstract :Using the Aspergillus Kawachii genetic engineering strain TR12 and Aspergillus niger 34309 as the original strains, two parent protoplasts were obtained respectively in cellulase solution or mixed solution with cellulase and lysozyme .Based of the study on the impact to the protoplasts under different conditions of culture time , culture method , enzymolysis time and prescription of enzymolysis solution , protoplasts fusion was done in the PEG solution .Then mutation breeding was made with ultraviolet ray radiation .Through comparing its colony appearance , color and configuration with TR12 and 34309 , while carried through isolation culture and shaker-flask culture , finally screen a better strain .The enzymic activities of acid stable α-amylase and glucoamylase reached 91 .2 u/ ml and 3216 .2 u/ml , respectively . Key words:protoplast fusion ;mutation breeding ;liquid culture ;screening
融合子再生的操作步骤和原生质体再生的操作 基本相同 。把融合子悬浮液 100000 个/ml 用紫外灯 距离 30 cm 照射 10 min 进行诱变 , 诱变结束后在黑 暗处静置 30 min 后涂布再生培养基平板 , 经培养后 进行菌落的外观 、颜色及形态选择并接种斜面 。 1 .2 .6 高酶活力菌株的筛选
收稿日期 :2003-01-14 基金项目 :教育部留学回国人员启动基金资助项目 作者简介 :张文学(1963-), 男 , 研究员 .研究方向 :食品生物技术 .
交频率高 , 进行杂交所受的限 制小 , 重 组体种类较 多 , 遗传物质的传递更为完整 , 可以获得性状优良的 重组体等优点 。 除此以外 , 原生质体融合技术还具 有存在着两株以上同时参与融合以形成融合子的可 能 , 以及提高菌株产量的潜力几率较大等特点[ 1] 。
液体培养基使用无琼脂的 2 %YPD , 其它同固体 培养法 。 1 .2 .3 原生质体的再生及再生率[ 6]
将制得的原生质体悬液 , 用无琼脂的液体再生 培养基稀释到 100000 个/ml ;用无菌的吸管吸取 0 .1 ml 均匀涂布在固体再生培养基平板上 , 32 ℃培养 24 h , 菌落计数 。 利用算式 :
原生质体融合技术起源于 60 年代 , 而后不断的 丰富和发展 , 至今 , 已经形成了原生质体融合育种 , 原生质体诱变育种和原生质体转化育种等一系列技 术 。自 1979 年 , 匈牙利的 Pesti 首先提出融合 育种 提高青霉素产量的报告后 , 这项技术已经越来越广 泛的应用于实际工作中 。 原生质体融合技术具有杂
第 35 卷 第 6 期 2003 年 11 月
四 川 大 学 学 报 (工 程 科 学 版 )
JOURNAL OF SICHUAN UN IVERSITY (ENGINEERING SCIENCE EDITION)
Vol .35 No .6 No v .2003
液体 深 层 发 酵培 养 基 :玉米 粉 5 %, 玉 米 浆 2 %, 黄豆粉 2 %, 麸皮 3 %, 柠檬酸调 pH 值 3 .5 左 右。 1 .1 .2 试剂
PBA 试 剂[ 1] , 渗 透 压 稳 定 剂[ 4] , 助 融 合 剂 PEG[ 1] 。
酶解 液 1[ 5] :1 g/L 纤 维 素 酶 , 1/ 15 mol/L K2HPO4 , 1/15 mol/ L KH2PO4 , 0 .6 mol/ L NaCl 。
1 实验部分
1 .1 实验材料 1 .1 .1 菌种及培养基
白曲霉基因工程菌 TR12 、黑曲霉 34309 由本实 验室保存 。
2 %YPD 培养基[ 2] ;淀粉培养基[ 2] ;X 培养基[ 2] ; 再生培养基[ 1] 。
液体深层发酵种子培养基 :玉米粉 6 %, 玉米浆 2 %, 黄豆粉 2 %, pH 自然 。
黑曲霉 34309 /(cell·ml -1)
4 .0 ×107 0 .9 ×107
酶和纤维素酶 、溶菌酶的混合酶液制得了两个亲 本的原 生质体 。 在 研究了 培养时 间 、培 养方法 、酶 解时间 、酶解 液
的配 比等条件对原生质体产量影响的基础上 , 以 PEG 诱导进行 了原生质 体的融合 , 并进 行了紫外 线照射 的诱变 育
种 。 通过比较在菌落外观 、颜色及形态上与白曲霉和黑曲 霉菌株的不同 , 以及进行 分离培养和 液态培养 摇瓶筛选 ,
耐酸性 α-淀粉酶活力 :采用修改的二硝基水 杨酸法[ 8] , 酶活力的定义为 , 在 40 ℃、pH =4 .35 每 分钟从可溶性淀粉中释放出 1 μmol 还原糖所需的酶 量。
糖化酶活力 :参照 DNS 试剂 法[ 8] , 酶活力的定 义为 , 在 50 ℃, pH =4 .5 每小时生成 1 mg 葡萄糖所
酶解液 2[ 5] :2 g/ L 纤维素酶 , 1 g/ L 溶菌酶 , 1/15 mol/ L K2HPO4 , 1/ 15 mol/ L KH2PO4 , 0 .6 mol/ L NaCl 。 1 .2 实验方法 1 .2 .1 菌种的扩大培养
挑取适量白曲霉 TR12 和黑曲霉 34309 的孢子 , 接种于 2 %YPD 固体培养基斜面上 , 放置在 32 ℃的 培养箱中培养 3 ～ 4 d , 使其生长成为带有孢子的成 熟菌体 , 4 ℃保存备用 。 1 .2 .2 原生质体的制备
菌种分离 :选择在菌落外观 、颜色及形态上与出 发菌株有差异 、产孢子较多且长势较好的斜面分别 进行摇瓶培养 , 取适量发酵液点滴淀粉培养基平板 , 经透明圈试验初步筛选后 , 选出菌株进一步摇瓶培 养筛选 , 经多轮淘汰后选留的几株斜面制成孢子悬 浮液 , 分别涂布多个茄子瓶斜面 , 在 32 ℃培养 5 ～ 7 d 后 , 选取斜面生长情况稳定的菌株进行再次的生 产水平检测 。
再生率 =(B/ A)×100 %。 计算出再生率 。其中 , A 为长出的菌落数 ;B 为原生 质体总数 。 1 .2 .4 原生质体的融合[ 7]
将制备好的原生质体等量混合于大试管 , 加入 适量预热的 PEG 助融 , 振荡均匀后置 28 ℃处理 15 ～ 20 min ;将适量冷的 PBA 试剂(pH 7 .0)移入离心管 终止融合 , 低速离心机趁冷离心(1000 r/min , 5 min)、 洗涤一次 。 1 .2 .5 融合子的再生及诱变
获得了一株具有较高酶活力的新菌株 , 其耐酸性 α-淀粉酶活性和糖化酶活性分别达到 91.2 u/ ml 和 3216.2 u/ ml 的
水平 。
关键词 :原生质体融合 ;诱变育种 ;液态培养 ;筛选
中图分类号 :Q939.97
文献标识码 :A
Screening of Higher Enzyme Activity Strain with Protoplast Fusion and Mutagenisis
损 , 有利于原生质体的释放 。
表 2 物理因素对原生 质体数量的影响 Tab.2 Effect of physical condition on
the amount of protoplasts
菌株
进行机械破碎处理 不进行机械破碎处理
白曲霉 TR12 /(cell·ml -1)
7.8 ×107 2.1 ×107
本研究室基于我国在耐酸性 α-淀粉酶研究上 的不足以及我国白酒工业 、淀粉糖工业 、酒精等发酵 工业对耐酸性 α-淀粉酶实际需求 的增加 , 利用基 因工程技术获得了具有多拷贝耐酸性 α-淀粉酶和
第 6期
张文学 , 等 :利用原生质体融合和诱变育种技 术选育高酶活菌株
67
糖化酶融合基因的白曲霉 工程菌 TR12 菌株 , 在液 态 AP 培养基中培养 , 其产耐酸性 α-淀粉酶和糖化 酶能力较亲株提高 6 ～ 7 倍 , 但菌种的生长繁殖速度 较慢 , 培养周期较长[ 2 , 3] 。 因而 , 本研究拟利用以上 原生 质体融合技术的 优点 , 将 白曲霉工程菌 TR12 菌株与实验室保存的具有较快生长繁殖速度的黑曲 霉 34309 菌株融合 , 再加以诱变育种和筛选 , 分离出 既具有较高产酶活力 , 又能缩短培养周期的新菌株 类型 。
摇瓶筛选 :种子培养 :250 ml 的三角瓶装 50 ml 种子培养基 , 灭菌接种后 , 在 210 r/min 旋转摇床上 32 ℃培养 24 h 。发酵培养 :250 ml 的三角瓶装 30 ml 发 酵培养基灭菌 后 , 按10 %的接种 量接种 , 在210 r/min 旋转摇床上 32 ℃恒温培养 72 h , 测耐酸性 α淀粉酶 , 糖化酶的活力 。 1 .2 .7 酶活力的测定
68
四川大百度文库学报(工程科学版)
第 35 卷
需的酶量 。
2 结果与讨论
2 .1 原生质体的制备 2 .1 .1 影响原生质体产量的因素
实验中发现 , 培养时间 、培养方法 、机械破碎处 理 、酶解时间 、酶解液的配比 、酶解温度对原生质体 的产量均有很大影响 。 在培养时间上 , 见图 1 以 14 h 的菌丝体的酶解效果最佳 。其原因可能是由于 14 h 时 , 菌体生长达到对数生长期的高峰 , 菌丝体含量 较多 , 且幼龄菌细胞壁较薄 , 结构比较简单脆弱 , 容 易被玻棒和玻璃珠破坏 , 使酶解液的作用效果最好 。 随着培养时间的继续增长 , 壁生沉积色素等次生物 质 , 阻碍了酶解液的作用 , 使细胞壁难以解体释放出 原生质体 。
固体培养法[ 5] (玻璃纸法): 将斜面培养基的孢子制成悬液 , 均匀涂布于表 面覆盖有玻璃纸的 2 %YPD 平板上 , 在 32 ℃培养 14 h ;将玻璃 纸上菌丝体 进行酶解 , 后用 冰浴终止 酶 解 ;酶解液用无菌镜头纸过滤 , 滤液移入离心管在低 速离心机中离心 , 去除上清液 , 用少量 0 .6 mol/ L NaCl 洗涤离心后 , 加入少量 0 .6 mol/ L NaCl , 4 ℃保存 。 液体培养法 :
文章编号 :1009-3087(2003)06-0066-05
利用原生质体融合和诱变育种技术选育高酶活菌株
张文学 , 刘春莉 , 蒋 宏
(四川大学 食品科学与工程系 , 四川 成都 610065)
摘 要 :以白曲霉(Aspergillus kawachii)基因工程菌 TR12 和黑曲霉(Aspergillus niger)34309 为出发菌株 , 分别用纤维素
ZHANG Wen-xue , LIU Chun-li , JIANG Hong
(Dept .of Food Sci .and Eng., Si chuan Univ., Chengdu 610065 , China)
Abstract :Using the Aspergillus Kawachii genetic engineering strain TR12 and Aspergillus niger 34309 as the original strains, two parent protoplasts were obtained respectively in cellulase solution or mixed solution with cellulase and lysozyme .Based of the study on the impact to the protoplasts under different conditions of culture time , culture method , enzymolysis time and prescription of enzymolysis solution , protoplasts fusion was done in the PEG solution .Then mutation breeding was made with ultraviolet ray radiation .Through comparing its colony appearance , color and configuration with TR12 and 34309 , while carried through isolation culture and shaker-flask culture , finally screen a better strain .The enzymic activities of acid stable α-amylase and glucoamylase reached 91 .2 u/ ml and 3216 .2 u/ml , respectively . Key words:protoplast fusion ;mutation breeding ;liquid culture ;screening
融合子再生的操作步骤和原生质体再生的操作 基本相同 。把融合子悬浮液 100000 个/ml 用紫外灯 距离 30 cm 照射 10 min 进行诱变 , 诱变结束后在黑 暗处静置 30 min 后涂布再生培养基平板 , 经培养后 进行菌落的外观 、颜色及形态选择并接种斜面 。 1 .2 .6 高酶活力菌株的筛选
收稿日期 :2003-01-14 基金项目 :教育部留学回国人员启动基金资助项目 作者简介 :张文学(1963-), 男 , 研究员 .研究方向 :食品生物技术 .
交频率高 , 进行杂交所受的限 制小 , 重 组体种类较 多 , 遗传物质的传递更为完整 , 可以获得性状优良的 重组体等优点 。 除此以外 , 原生质体融合技术还具 有存在着两株以上同时参与融合以形成融合子的可 能 , 以及提高菌株产量的潜力几率较大等特点[ 1] 。
液体培养基使用无琼脂的 2 %YPD , 其它同固体 培养法 。 1 .2 .3 原生质体的再生及再生率[ 6]
将制得的原生质体悬液 , 用无琼脂的液体再生 培养基稀释到 100000 个/ml ;用无菌的吸管吸取 0 .1 ml 均匀涂布在固体再生培养基平板上 , 32 ℃培养 24 h , 菌落计数 。 利用算式 :
原生质体融合技术起源于 60 年代 , 而后不断的 丰富和发展 , 至今 , 已经形成了原生质体融合育种 , 原生质体诱变育种和原生质体转化育种等一系列技 术 。自 1979 年 , 匈牙利的 Pesti 首先提出融合 育种 提高青霉素产量的报告后 , 这项技术已经越来越广 泛的应用于实际工作中 。 原生质体融合技术具有杂