实验酶切和连接

DNA DNA克隆的技术路线大致 包括以下几个程序：① 分离制 备待克隆的DNA片段(目的 DNA)。② 选择合适的载体 。 ③在体外连接目的DNA和载体。 ④将重组DNA分子转入宿主细 胞，并筛选和鉴定阳性重组子。 ⑤ 扩增阳性重组子。
实验九 质粒酶切与鉴定
一. 实验目的
1. 了解质粒酶切鉴定原理。 2. 掌握核酸片断回收纯化操作技术 3. 学习核酸片断连接的原理和方法

DNA片段之间的连接 主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核 苷酸裸露的3’羟基和 5’磷酸之间形成共价结合 的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,
需ATP。
连接酶：把基因连在一起
二. 仪器和试剂
1. 仪器： 离心机 ， 水浴锅， 电泳仪
2. 材料：待回收DNA样品
3.试剂：
1) DNA回收试剂盒 2）T4 DNA连接酶 3）10X T4 DNA ligase buffer：Tris-HCl（pH 7.6）； MgCl2；DTT；ATP。
5）取回收试剂盒中吸附柱EC装在2ml收集管上，将上一步所得 溶液加入吸附柱EC中。室温放置1min, 12000rpm离心 1min,弃去收集管中平衡液，将柱子套回；
6）加入700ul 漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心 1min ，弃去废液； 7）加入500ul 漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm离心 1min，弃去废液；
三. 操作步骤
1. DNA酶切条带回收
（北京艾德莱生物胶回收试剂盒）
1) 用干净无菌的刀片在 365 nm紫外光下切割目的 DNA 条带，放入1.5mL Ep管中，积累凝胶至大约300ul。
2)将目标片段切下的胶转移到预先称重的1.5ml eppendorf 管中，称取凝胶重量。按照0.1g=100ul估算凝胶体积， 3) 加入3倍体积的溶胶液DD。 4) 56℃水浴 10min或直到凝胶完全溶解。每隔2 min摇荡 一次。
3．试剂 （1）限制性内切酶Not I及相应的缓冲液； （2）电泳试剂 1xTBE 缓冲液 EB 染色液(0.5μg/mL)。
四. 操作步骤
1. 反应体系的建立： ⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入： 无菌双蒸水 10×酶切缓冲液 质粒DNA(100 ng/μl) NotⅠ(10U/μl) 10.5 μl 2 μl 7 μl 0.5 μl
（3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般 采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们 的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所 用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘 端连接、平端连接和不相配的连接。 （4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主 细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿 主细胞新的生物特征。 （5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平 板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定 或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。
总体积为20μl
⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。
2. 37 ℃水浴1 h。 3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失 活以终止反应。
操作注意事项： 1. 吸样量一定要准确 2. 加样按体积从大到小，最后加酶 3. 要求在冰上操作，并充分混匀， 4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以 防污染。 5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防 水进入管内造成实验失败。
DNA克隆（重组）技术的基本程序包括： （1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的 DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录DN载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在 特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、 噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直 接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。
（4） 电泳 120V电泳，当指示剂前沿移动至距离胶板1~2cm 处， 停止电泳。 （5） 观察 紫外等下观察琼脂糖凝胶中的DNA 条带。
实验十 DNA片断的回收
纯化及连接
一. 实验原理 (目的片段的回收与连接)
载体及目的DNA片断经酶切后，必须电泳分离后回收目 的片断。 回收的方法 传统的方法：基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后通过 酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。 商品化的试剂盒：采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的 NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA 后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。
二. 实验原理 (质粒酶切与鉴定 )
使用限制性内切酶获得粘性末端的目的基因


核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用 于抗击外来ＤＮＡ的侵袭 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为Ｏ Ｈ。
限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识 别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异 性核苷酸序列内，切断DNA 的双链，形成一定长度和顺序 DNA 片段。如：Not I的识别序列和切口是：
限制性内切酶切口
酶切片段 电泳凝胶的区带数, 酶切片段大小
三. 仪器和试剂
1．主要仪器 （1） 1.5mL塑料离心管 （2）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支 （3）台式高速离心机（20 000r/min） （4）水浴锅 （5）电泳仪，电泳槽 2．材料 大肠杆菌DH5α质粒
4．DNA 琼脂糖凝胶电泳检测
（1）水平放置胶槽，放入合适的梳子。 （2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g 琼脂糖，置于 三角瓶中，加入30 mL TBE 缓冲液，微波炉加热融解， 待冷却至65℃左右加入2ul EB，将凝胶液缓慢倒入胶槽， 室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，将 胶板放在电泳槽中使用。 （3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样 品小槽内。