超高分辨率显微镜简介

42
The principle of STORM
43
The principle of STORM
44
The principle of STORM
45
The principle of STORM
46
The principle of STORM
47
The principle of STORM
© OLYMPUS SOFT IMAGING SOLUTIONS GMBH 08/12/2014
Page 25
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF示例一
WF
TIRF
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF示例一
TIRF：微丝的生发
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
样品准备(重要性> 50%)
合适条件促发‘闪烁点’并成像记录
1. TIRF公认的最佳光学质量.
从多样性的算法中选择合适的 筛选符合要求的‘闪烁点’
重建突破光学衍射限制(超分辨率)的图像
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
最新超分辨技术
共聚焦
Schermelleh L et al. J Cell Biol 2010;190:165-175
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
最新超分辨技术
超高分辨率
120nm
Schermelleh L et al. J Cell Biol 2010;190:165-175
有没有更方便的超高分辨率技术？ 1、没有特殊染料限制 常规染料就可观察？
2、不需要重复激活、灭活，一次成像即可获得？ 3、可同时进行双通道超高分辨率成像？ 4、可观察活细胞？ 5、可观察任意层面超分图像，无标本厚薄限制？ 6、可与共聚焦匹配，一键切换？
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
35
Many Molecules
36
The principle of STORM
37
The principle of STORM
38
The principle of STORM
39
The principle of STORM
40
The principle of STORM
41
The principle of STORM
超高分辨率成像技术
Stimulated emission depletion (STED) Structured Illumination Microscopy (SIM) Single-Molecule Localization Microscopy

– photoactivated localization microscopy (PALM) – stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) – fluorescent photoactivation localization microscopy (FPALM)
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
FV-OSR
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
FV-OSR
更多精彩，敬请期待
7
一. STED
8
STED原理:
9
10
STED
以光制光
1 蓝激光激发出绿光 2 用红激光产生受激发射（甜甜圈） 3 红绿两色同时产生，用滤光片过滤红色 4 获得小于200nm的绿色光斑 1994年 理论提出 2008年 商品化
11
实际样品 成像测试
图片由IBP季伟老师提 供
12
二.SIM
传统显微镜局限
1. 传统光学显微镜
观察细胞内器官/病毒/寄生虫三维空间精确定位和分布 蛋白质结构/定位/功能关系,蛋白质-蛋白质相互作用时空顺序 活性因子调节细胞生命活动
以上活动均在nm量级,而传统光学显微镜在水平 200nm,Z轴500nm范畴
2.电子显微镜
能观察细胞内囊泡/线粒体定位,但缺乏特异性探针, 不适合定位单个蛋白质分子 ,不能对活细胞观察 6
University of California, Mats G.L. Gustafsson提出
13
SIM原理
14
SIM原理
15
SIM
16
三.单分子定位显微成像技术


PALM / STORM 基于全内反射荧光(TIRF)成像技术： 有效减少背景信号及有利于单分子荧光信号的采集 TIRF = Total Internal Reflection Fluorescence
Dr. Colin Rickman, Heriot-Watt University
B. PALM
54
B.
PALM
Eric Betzig、Harald Hess以及 Jennifer Lippincott-Schwartz 小组 2006年开发出的一种新 的方法，与STORM相似 所用 荧光探针不同
17
单分子质心确定—数学运算
18
TIRF
全内反射荧光
19
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF 原理: Snells’ Law
n1 < n2
n1 = n2
n1 > n2
n2
EPI
90 θo 2
θ’1
wenku.baidu.com
介质面 θ1= θ’1 (反射)
n1
θc θ 1
Snells’ Law
白定位的一种超高分辨率 方法。
34
2006年，哈佛大学庄小威从化学生物学角度提出了她 的新方法，利用荧光探针家族，实现了随机光学重建显 微法。Stochastic Optical Reconstruction Microscopy 核心原理是利用光线“开关”，“随机”地让被观测物 体上的点发光或熄灭，这样就拉远了两个发光点之间的 距离，相机不断动态捕捉这样的成像，再经过计算机分 析，就会形成被观测物体整体的图像
宽场
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF示例二：囊泡的释放
TIRF示例三：细胞的运动
Confocal：Actin Run
TIRF：Actin Run
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF示例四：模拟癌细胞沉降
TIRF示例五：溶酶体酸性物质的释放
Particle detection and image reconstruction using ImageJ and QuickPALM plugin.
Original Data Courtesy of Colin Rickman: Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh
TIRF
1
1
2
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
利用消逝波 可以对贴壁细胞50-300nm内的荧光标记物质 进行荧光观察。 分子扩散 • 信使/转运分子动力学 • 膜融合 • 细胞/细胞的相互作用 • 细胞骨架动力学 囊泡运动、溶酶体、胞吞 胞吐 单分子检测
为什么白天看不到星星?
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF 技术，让我们以极高的信噪比对超薄Z轴空间（50nm） 的荧光进行检测 超高的信噪比 让我们可以检测到 单分子 检测到单分子，基于此，有了单分子定位超高分辨率技术
A. STORM
33
STORM
庄晓威2006年提出的方法 基于高精度光转化荧光蛋
超高分辨率显微镜简介
阿贝衍射极限: 光学显微镜分辨率提高绕不开的大山
1873年，德国科学家阿贝提出了 衍射极限理论：光是一种电磁波， 由于存在衍射，一个被观测的点 经过光学系统成像后，不可能得 到理想的点，而是一个衍射像， 每个物点就像一个弥散的斑，如 果这两个点靠得很近，弥散斑就 叠加在一起，我们看到的就是一 团模糊的图像。
55
56
PALM图片
57
PALM
图片由北京大学陈良怡老师提供
58
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
常用超分辨率显微镜技术分辨能力比较
Schermelleh L et al. J Cell Biol 2010;190:165-175
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
成功的烟火晚会
白天不适合放烟火
不适合短时间内放太多,或长时间内放太少
发射和拍摄的精确控制 后期处理
Series of a few thousand images are acquired. *Critically depends on the labeling density and the imaged biological structure.
光入射到不同介质的界面上会发生反射和折射 当入射角为临界角时，光沿介质表面传播 当入射角大于临界角时，发生全反射现象
WF
C.A.
TIRF
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
TIRF 原理: 消逝波和渗透深度
消逝波:z轴强度指数性衰减
Z
渗透深度 50 – 300 nm
48
TIRF/单分子定位·超分辨率 奥林巴斯高端Xcellence系统
点描法(点彩派画法)
点分布函数(PSF),信噪比(S/N)决定计算分辨率
La Parade de Cirque (1889)
样点量决定计算分辨率
The Sunday Afternoon on the Island of La Grande Jatte (1884–1886)
2
阿贝衍射极限: 光学显微镜分辨率提高绕不开的大山
3
阿贝衍射极限: 光学显微镜分辨率提高绕不开的大山
4
阿贝衍射极限: 光学显微镜分辨率提高绕不开的大山
阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。 可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式， 光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果 物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很 长一段时间内，光学显微镜的分辨极限。 电镜是否绕过了阿贝定律，突破光学极限了呢？ 没有! 电镜使用了更短的入射光波长。