淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌实验实验报告

相关实验详细介绍

实验结果与讨论

参考文献

1、相关背景

1、1淀粉酶

1、1、1 淀粉酶的发现和分类

淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类。

第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以钙离子为必需

因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。

按照使用条件α-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。

第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。

第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。

1、1、2 淀粉酶的工业应用

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，自1973年问世以来，使双酶糖化发生产葡萄糖真正在工业上得到应用。耐热性α-淀粉酶也适用于棉布退浆及石油压裂液处理等。米曲霉α-淀粉酶耐热性差，应用面包工业，可避免应用高温α-淀粉酶而使面包过度液化，口感变差的现象，黑曲霉酸性α-粉酶适用于消化药物制造，糖化性细菌淀粉酶具有较多的麦芽糖，可以制造糖浆，α-淀粉酶在工农业生产中有许多用途，祥见表一中。

β-淀粉酶也是一种应用广泛的淀粉酶。作为一种糖化剂，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。

1、1、3 淀粉酶的临床意义

增高：见于胰腺肿瘤引起的胰腺导管阻塞、胰腺脓肿、胰腺损伤、肠梗阻、胃溃疡穿孔、流行性腮腺炎、腹膜炎、胆道疾病、急性阑尾炎、胆囊炎、消化性溃疡穿孔、肾功能衰竭或肾功能不全、输卵管炎、创伤性休克、大手术后、肺炎、肺癌、急性酒精中毒、吗啡注射后，以及口服避孕药、磺胺、噻嗪类利尿剂、鸦片类药物（可待因、吗啡）。麻醉止痛剂等。

减低：见于肝硬化、肝炎、肝癌、急性或慢性胆囊炎等。

胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道，是最重要的水解碳水化合物的酶，和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于α-淀粉酶，作用于α-1，4糖苷键，对分支上的α-1，6糖苷键无作用，故又称淀粉内切酶，其作用的最适pH 为6.9，可通过肾小球滤过，是唯一能在正常时于尿中出现的血浆酶。

人体的其他组织如卵巢、输卵管、肺、睾丸、精液、乳腺等的提取物中都发现有淀粉酶活性;血液、尿液、乳液中也含淀粉酶。血液淀粉酶中主要来自胰腺、唾液腺，尿液中淀粉酶则来自于血液。

测定血清淀粉酶同工酶时，发现有两个主要的同工酶区带及数个次要区带。两个主要区带中的一个和胰腺的提纯物或分泌物电泳的位置相同，因此命名为P-同工酶;另一个和唾液腺提纯物或唾液电泳在同一位置，因此命名为S-同工酶。测定淀粉酶同工酶有助于对胰腺疾病的鉴别诊断。

参考值：限定性底物法：

血清淀粉酶220U/L(37℃)

尿淀粉酶1200U/L(37℃)

P同工酶血清115U/L

尿800U/L

新生儿血清淀粉酶约为成年人的18%，主要为S-型，到5岁时达成人水平;在一岁内测不出血清P-型淀粉酶，以后缓慢上升，在10～15岁时达成人水平。

血清淀粉酶和尿淀粉酶测定是胰腺疾病最常用的实验室诊断方法，当罹患胰腺疾病，或有胰腺外分泌功能障碍时都可引起其活性升高或降低，有助于胰腺疾病的诊断。尿淀粉酶水平波动较大，所以用血清淀粉酶检测