荧光光谱在蛋白质结构中的应用
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Yf=kf /(kf+ ∑K) 可见荧光量子产率的大小取决与荧光发射过程与非 辐射跃迁过程的竞争结果。
假如非辐射跃迁的速率远小与辐射跃迁的速率即 ∑K<<kf ，则Yf的数值便接近于1。 通常情况下Yf 的数值总是小于1， Yf 的数值越大，化 合物的荧光越强。荧光量子产率的大小，主要取决 与化合物的结构与性质，同时也与化合物所处环境 有关。
荧光光谱的相关概念
1、激发光谱 2、发射光谱 3、荧光寿命和荧光量子产率 4、荧光强度与溶液浓度的关系
1、激发光谱
激发光谱是指引起荧光的激发辐射在不同 波长的相对效率。把荧光样品放入光路之 后，选择合适的发射波长与狭缝宽度，并 使之固定不变，然后令激发单色器扫描， 即可得到激发光谱。激发光谱的形状与选 择的发射波长无关，但其相对强度与所选 择的发射波长有关。发射波长固定在它的 峰位时，所得的激发光谱最大。
荧光光谱在蛋白质结构中的应用
李强 0710219 黄雄 0710209 李承珉 0710214
蛋白质结构的研究方法
1.测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共 振法,圆二色谱法, 激光拉曼光谱法, 荧光光 谱法。 2测定晶体蛋白质的分子结构。如X射线衍 射分析法。 两者的共同之处是可以用蛋白质溶液进行 测量，而且不破坏蛋白质的结构。
3、荧光寿命和荧光量子产率
除常用的荧光量子产率外，在过去的论 文或著作中也出现过“荧光的能量产率” 和“荧光的量子效率”的术语。其分别表 示荧光所发射的能量与所吸收的能量的比 值以及处于发射荧光的激发电子态的分子 百分数。 对这些概念应该有一定的了解。
3、荧光寿命和荧光量子产率
有分析应用价值的荧光化合物，其荧光量 子产率的数值一般通常处于0.1~1之间。
荧光光谱法的优点
荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种 有效方法。它能提供包括激发光谱、发射光谱 以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数, 这些参数从各个角度反映 了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的 测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以 推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化, 从 而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。同时, 荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样 量少、方法简便等优点。所以, 该方法在蛋白 质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。
2、发射光谱
与激发光谱密切相关的是发射光谱。它 是由于分子吸收辐射后再发射的结果。把 样品放入光路中后，选择合适的激发波长 和狭缝，使之固定不变，然后扫描发射波 长，即可得到发射光谱。
一般来说，发射光谱的形状与激发波长 的形状无关。但当激发波长选在远离激发 峰的地方，发射强度就小。除此之外，发 射波长总是比激发波长要长，且发射光谱 与吸收光谱呈镜像对称关系。
3、荧光寿命和荧光量子产率
荧光寿命和荧光量子产率是荧光物质的重要发光参数。 荧光寿命（ζ）定义为当激发光切断后荧光强度衰减至原 强度的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态 的平均寿命。
ζ=1/(kf+∑K) 式中：kf 表示荧光发射的速率常数； ∑K代表各种分子 内的非辐射衰变过程的速率常数的总和。
没有非辐射衰变过程存在的情况下，荧光分子的寿命 称为内在寿命，用ζ0 表示。 ζ0 =1/kf
荧光强度的衰变，通常遵循以下方程Hale Waihona Puke Baidu： lnI0-lnIt=t/ζ
式中：I0 和It分别表示t=0和t=t时刻的荧光强度。
3、荧光寿命和荧光量子产率
荧的光荧量光子的产光率子（数Y与f）所定吸义收为的荧激光发物光质的吸光光子后数所之发比射值。
荧光光谱的测量原理
也就是说频率为ν的单色光的能量必定是 hν的整数倍。每个量子能量为：
E=hν=h c/ λ=hcw (2) h为普朗克常数、w为波数。 可见，能量E与波长λ成反比，波长越长，能
量越小
荧光光谱的测量原理
吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图
荧光光谱的测量原理
光照射物质时，光子打到分子上，大约在 10-15秒内被吸收，原来处于基态的电 子被激发到较高的能级，从而使分子 处在激发态。此后，激发态分子通过 内转换过程把部分能量转移给周围分 子，使较高激发态的电子很快回到最 低激发态的最低振动能级（亦称第一 单线态）。处在第一单线态的分子的 平均寿命是10^-8秒左右。如果这种分 子通过发射出相应的光子而回到基态 的各个不同的振动能级，即可产生荧 光，根据回到的振动能级的不同，荧 光的波长就不同，从而形成荧光发射 带光谱。由于发射荧光前已有一部分 能量被消耗，所以发射荧光所相应的 能量要比物质吸收的光能量小，故而 荧光的发射特征波长总比激发特征波 长长。
If = Yf * Ia 而吸收的光强度等于入射的光强度减去统摄的光强度，于 是可得：
If = Yf *（I0 – It） 从比尔-朗伯定律可知： It/ I0=e-abc ,因此
If = Yf *I0（1 –e-abc） 当abc很小时（<<0.05），e-abc 近似为（1-abc），这时：
If = Yf *I0*abc; 当用摩尔吸光系数ε代替a时：
荧光光谱的测量原理
光是一种电磁波。它的频率与波长的关系为： ν=c/λ (1)
式中ν为频率、λ为波长、c为光速。
荧光光谱的测量原理
当光进入某种物质以后，可以有两种情况发生： 一种是进入物质后，能量几乎不被吸收； 另一种是能量被全部吸收或被部分吸收。
在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被 转移给分子。但是吸收本身是一种高度专一的 现象，即一定结构的分子只能吸收一定能量的 辐射。根据量子理论，分子从光波中吸收能量 必定是以不连续的、整份单位的形式发生，这 些不连续的微小能量单位称为量子。
任何能影响激发态分子的光物理过程的速 率常数的因素，都将使荧光的寿命和量子 产率发生变化。如：随着温度的升高，由 于增大非跃迁过程的速率常数，从而使荧 光的寿命和荧光量子产率下降。
4、荧光强度与溶液浓度的关系
荧光既然是物质在吸光之后发射的辐射，因而溶液的荧光 强量度子（产I率f）（应Y与f）该有溶关液：吸收的光强度（Ia）及该物质的荧光
假如非辐射跃迁的速率远小与辐射跃迁的速率即 ∑K<<kf ，则Yf的数值便接近于1。 通常情况下Yf 的数值总是小于1， Yf 的数值越大，化 合物的荧光越强。荧光量子产率的大小，主要取决 与化合物的结构与性质，同时也与化合物所处环境 有关。
荧光光谱的相关概念
1、激发光谱 2、发射光谱 3、荧光寿命和荧光量子产率 4、荧光强度与溶液浓度的关系
1、激发光谱
激发光谱是指引起荧光的激发辐射在不同 波长的相对效率。把荧光样品放入光路之 后，选择合适的发射波长与狭缝宽度，并 使之固定不变，然后令激发单色器扫描， 即可得到激发光谱。激发光谱的形状与选 择的发射波长无关，但其相对强度与所选 择的发射波长有关。发射波长固定在它的 峰位时，所得的激发光谱最大。
荧光光谱在蛋白质结构中的应用
李强 0710219 黄雄 0710209 李承珉 0710214
蛋白质结构的研究方法
1.测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共 振法,圆二色谱法, 激光拉曼光谱法, 荧光光 谱法。 2测定晶体蛋白质的分子结构。如X射线衍 射分析法。 两者的共同之处是可以用蛋白质溶液进行 测量，而且不破坏蛋白质的结构。
3、荧光寿命和荧光量子产率
除常用的荧光量子产率外，在过去的论 文或著作中也出现过“荧光的能量产率” 和“荧光的量子效率”的术语。其分别表 示荧光所发射的能量与所吸收的能量的比 值以及处于发射荧光的激发电子态的分子 百分数。 对这些概念应该有一定的了解。
3、荧光寿命和荧光量子产率
有分析应用价值的荧光化合物，其荧光量 子产率的数值一般通常处于0.1~1之间。
荧光光谱法的优点
荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种 有效方法。它能提供包括激发光谱、发射光谱 以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数, 这些参数从各个角度反映 了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的 测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以 推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化, 从 而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。同时, 荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样 量少、方法简便等优点。所以, 该方法在蛋白 质分子构象研究中得到越来越广泛的应用。
2、发射光谱
与激发光谱密切相关的是发射光谱。它 是由于分子吸收辐射后再发射的结果。把 样品放入光路中后，选择合适的激发波长 和狭缝，使之固定不变，然后扫描发射波 长，即可得到发射光谱。
一般来说，发射光谱的形状与激发波长 的形状无关。但当激发波长选在远离激发 峰的地方，发射强度就小。除此之外，发 射波长总是比激发波长要长，且发射光谱 与吸收光谱呈镜像对称关系。
3、荧光寿命和荧光量子产率
荧光寿命和荧光量子产率是荧光物质的重要发光参数。 荧光寿命（ζ）定义为当激发光切断后荧光强度衰减至原 强度的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态 的平均寿命。
ζ=1/(kf+∑K) 式中：kf 表示荧光发射的速率常数； ∑K代表各种分子 内的非辐射衰变过程的速率常数的总和。
没有非辐射衰变过程存在的情况下，荧光分子的寿命 称为内在寿命，用ζ0 表示。 ζ0 =1/kf
荧光强度的衰变，通常遵循以下方程Hale Waihona Puke Baidu： lnI0-lnIt=t/ζ
式中：I0 和It分别表示t=0和t=t时刻的荧光强度。
3、荧光寿命和荧光量子产率
荧的光荧量光子的产光率子（数Y与f）所定吸义收为的荧激光发物光质的吸光光子后数所之发比射值。
荧光光谱的测量原理
也就是说频率为ν的单色光的能量必定是 hν的整数倍。每个量子能量为：
E=hν=h c/ λ=hcw (2) h为普朗克常数、w为波数。 可见，能量E与波长λ成反比，波长越长，能
量越小
荧光光谱的测量原理
吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图
荧光光谱的测量原理
光照射物质时，光子打到分子上，大约在 10-15秒内被吸收，原来处于基态的电 子被激发到较高的能级，从而使分子 处在激发态。此后，激发态分子通过 内转换过程把部分能量转移给周围分 子，使较高激发态的电子很快回到最 低激发态的最低振动能级（亦称第一 单线态）。处在第一单线态的分子的 平均寿命是10^-8秒左右。如果这种分 子通过发射出相应的光子而回到基态 的各个不同的振动能级，即可产生荧 光，根据回到的振动能级的不同，荧 光的波长就不同，从而形成荧光发射 带光谱。由于发射荧光前已有一部分 能量被消耗，所以发射荧光所相应的 能量要比物质吸收的光能量小，故而 荧光的发射特征波长总比激发特征波 长长。
If = Yf * Ia 而吸收的光强度等于入射的光强度减去统摄的光强度，于 是可得：
If = Yf *（I0 – It） 从比尔-朗伯定律可知： It/ I0=e-abc ,因此
If = Yf *I0（1 –e-abc） 当abc很小时（<<0.05），e-abc 近似为（1-abc），这时：
If = Yf *I0*abc; 当用摩尔吸光系数ε代替a时：
荧光光谱的测量原理
光是一种电磁波。它的频率与波长的关系为： ν=c/λ (1)
式中ν为频率、λ为波长、c为光速。
荧光光谱的测量原理
当光进入某种物质以后，可以有两种情况发生： 一种是进入物质后，能量几乎不被吸收； 另一种是能量被全部吸收或被部分吸收。
在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被 转移给分子。但是吸收本身是一种高度专一的 现象，即一定结构的分子只能吸收一定能量的 辐射。根据量子理论，分子从光波中吸收能量 必定是以不连续的、整份单位的形式发生，这 些不连续的微小能量单位称为量子。
任何能影响激发态分子的光物理过程的速 率常数的因素，都将使荧光的寿命和量子 产率发生变化。如：随着温度的升高，由 于增大非跃迁过程的速率常数，从而使荧 光的寿命和荧光量子产率下降。
4、荧光强度与溶液浓度的关系
荧光既然是物质在吸光之后发射的辐射，因而溶液的荧光 强量度子（产I率f）（应Y与f）该有溶关液：吸收的光强度（Ia）及该物质的荧光