基因表达载体的构建

起始密码子的结构特征 位于碱基配对区域 否 否 否 否 否 是 是 否 是 是 否
蛋白产量的相对浓度 876 476 375 265 236 1 18 12 44 14 13
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乳糖启动子（Lac）
• 无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻 止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。如图6-2
• 而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- β-D-半乳糖）诱导转录。 Lac启动子改建 如图6-3、 6-4(a) (b)
㈠ 有效转录及其调控元件
• 1. RNA聚合酶 • 2. 启动子及其转录作用的启动（启动子的概念、分类） • 3.转录作用的终止 • 4. 转录的弱化作用
㈡ 正确转译
• 1.起始密码子（intiqtion codon,initiator） • 2.核糖体结合位点（RBS，又称SD序列）
㈢ 原核表达载体的构建
RNA聚合酶
• 原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识别DNA 上的启动子进行转录。
启动子的概念
• 启动子是位于结构基因上游，转录起始调控所必需的一段DNA序列，内含-35区（与σ 因子结合）和-10区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1转录 起始点开始转录，如图6-1。
mRNA稳定性的影响 • REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子 也起保护作用。
真核基因在原核细胞中表达及调控的特点
1. 只有一种RNA聚合酶 2. 以操纵子为单位来完成基因转录 3. 基因转录无RNA剪接功能 4. 因无核仁、核膜，核酸均为裸露的，转录与翻译是连续进行的 5. 转录产物在多聚核糖体上合成，同时合成多条肽链 6. 有特有SD序列，调控mRNA与核糖体有效结合和翻译的起始 7. 无糖基化功能
表达载体的选择 • 载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。
外源基因（cDNA）中密码子的作用
• 细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差， 特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低
mRNA的一级结构与基因表达
1. 启始密码子：表达效率AUG>GUG>UUG
2.
SD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一
般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有
增强作用。
mRNA的二级结构对翻译起始的影响
• mRNA形成二级结构时，可产生茎环。若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受 抑制；在茎环外则有利于转译。见表6-1
一、基因表达的基本概念
生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是 目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表 达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作 用，其中转录最为关键，原核的基因表达过程和方式与真核细胞有显著不同。
但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。
脂蛋白启动子（LPP）
• 脂蛋白为细胞外膜蛋白，细菌中含量高，该启动子表达效率高，由信号肽可将基因表达 产物分泌到胞外，常用来构造分泌型表达载体。
基因 D K U V
MU3 A C H L M J
位于单链区域 是 是 是 是 是 否 否 是 否 否 是
Tac启动子
• Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子顺序， -10为LacUV5启动子顺序，二者之间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。该启动子只 需用IPTG诱导转录即可。如图6-7
噬菌体的PL和PR启动子 • PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动区，与CFra Baidu bibliotek阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR 转录，
转录作用的终止
• 由转录终止子发挥作用，凡能使转录终止的有关的DNA的序列称终止子。 • 强终止子：不依赖ρ因子发挥终止作用，回文序列中G/C配对多，有四个以上U，致使
RNA聚合酶构象改变而终止转录。如图6-9,如图6-10 • 弱终止子：依赖ρ因子发挥终止作用。如图6-11
转录的弱化作用
• 转录的弱化作用使转录没有到达终止信号处而中途停止转录，使mRNA转录发生部分停 止，而不是发生全部停止。
• 3. 外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA在菌体 必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶 的降解。
三、真核基因在原核细胞中表达及调控
• 真核基因在原核细胞中表达及调控的特点 • ㈠ 有效转录及其调控元件 • ㈡ 正确转译 • ㈢ 原核表达载体的构建
Trp启动子
• 色氨酸启动子（ Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与启 动子结合，阻止RNA聚合酶的转录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸 的竞争性抑制剂，常用作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。（如图6-5） 同时，衰减子 对Trp转录也有调节作用（如图6-6）
表达载体类型
•
表达载体的类型主要有四种：
1. 非融合型表达载体，如PKK223-3 如图6-14
2. 分泌型表达载体，如PINⅢ-ompA1 如图6-15
3. 融合蛋白型表达载体，如PGEX 如图6-16
4. 包涵体型表达载体，如pBV220 如图6-17
原核表达载体的构建的要求
• 完整的表达载体（质粒）应有强启动子（P）、终止子（T）、多个酶切位点、有抗性 标记、复制子和RBS的SD序列。（如图6-13）还应结合考虑：质粒的拷贝能力和稳定性， 转译蛋白的表达形式和存放地点（分泌型/包涵体/融合蛋白），蛋白质的分子量、性质 和稳定性以及选择合适宿主细胞。
起始密码子
• 起始密码子是编码多肽链第一位氨基酸的密码子AUG（或ATG），编码甲硫氨酸（蛋 氨酸）。在细菌中也有罕见的起始密码子GUG，编码缬氨酸。其起始表达作用AUG＞ GUG。
核糖体结合位点
• 转录mRNA的AUG上游具有的，能与核糖体发生有效结合和转译所需要的序列（RBS）， 长度为3-9bp，距AUG3-11bp，它与16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互补其 互补程度、SD与AUG间距等与转译效果有关。如图
基因表达载体的构建
第一节 基因表达的概述和基本条件
• 一、基因表达的基本概念 • 二、基因表达的基本条件 • 三、真核基因在原核细胞中表达及调控
第二节 在大肠杆菌中影响外源基因表达的因素
• 一、启动子结构对表达效率的影响 • 二、表达载体的选择 • 三、外源基因（cDNA）中密码子的作用 • 四、mRNA的一级结构与基因表达 • 五、mRNA的二级结构对翻译起始的影响 • 六、mRNA稳定性的影响 • 七、转录终止区对外源基因表达效率的影响 • 八、转录后的若干因素与基因表达的关系 • 九、宿主选择对表达的影响 • 十、培养条件的控制对表达效率的影响
二、基因表达的基本条件
• 1. 外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。其遗传密码不得缺失、遗漏、或 错位及错码。否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端 酶切位点的识别序列。
• 2. 插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够 识别插入的基因。
• 原核表达载体的构建的要求 • 1.表达载体类型 • 2.表达载体的举例 • 3.包涵体表达载体
• ⑴ 乳糖启动子（Lac） • ⑵ Trp启动子 • ⑶ Tac启动子 • ⑷ 噬菌体的PL和PR启动子 • ⑸ 脂蛋白启动子（LPP）
启动子
启动子结构对表达效率的影响
• 启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17 bp，大于17bp效果差，不同产 物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。