酶法水解大豆分离蛋白的研究_迟晓星
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实验结果得出的大豆分离蛋白的水解率为１０．０％ 左右，低于参考资料的１４．０％，原因可能是购买的 Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶的活力为１０００００Ｕ／ｇ，低于参考资 料上２３００００Ｕ／ｇ的标准，致使大豆分离蛋白的水解率 偏低。◇
表 ７ 蛋白液水解因素水平表
水平 １ ２ ３
加入酶量 Ａ（μ ｌ） 温度 Ｂ（℃） 时间 Ｃ（ｈ）
之后沸水浴中灭酶活 ２０ｍｉｎ，分别取 １ｍｌ 测水解度。
度的继续增大水解率呈下降趋势，说明蛋白液的浓度增
００００００００００００
２．２．２ 大豆分离蛋白浓度对水解度的影响 分别配置 大，导致酶底物浓度低，酶促反应速度下降，水解下降。
浓度为 ４％、６％、８％、１０％ 的大豆蛋白溶液。预处理同 ３．１．３ ｐＨ 值与水解度之间的关系 ｐＨ 值与水解度之
析仪器有限公司；Ｆ Ａ （Ｎ ）Ａ （Ｎ ）系列电子天平，上 海民桥精密科学仪器有限公司。
２ 方法
２．１ 分析方法 样品总氮的测定方法采用ＧＢ６４３２—８６，大豆分离
蛋白的水解度选用分光光度法。 ２．１．１ 大豆蛋白水解的测定 大豆蛋白水解的测定采 用校正后的茚三铜比色法即利用水解原料的完全水解液 作为标准，使结果更接近真实值。 ２．１．２ 完全水解蛋白液的制备 取大豆蛋白２５ｍｇ，放 入反应瓶中加入 ２５ｍｇ６Ｍ 盐酸，拧紧瓶盖，１００℃水解 ２４ｈ，冷却，过滤，滤液旋转蒸发器浓缩至 ０．５ｍｌ 左右， 加蒸馏水，用 １ＭＮａＯＨ 中和至中性（ｐＨ 值 ６），定容至 ２５ｍｌ。 ２．１．３ 工作曲线的绘制 取完全水解液０．１～０．８ｍｌ于 ２５ｍｌ 比色管中，蒸馏水稀释至 ２ｍｌ，加 ｐＨ 值为 ８ 的缓 冲溶液 ０．５ｍｌ，茚三铜溶液 ０．５ｍｌ，沸水浴加热 １６ｍｉｎ， 冷却，蒸馏水稀释至 ２５ｍｌ。５７０ｎｍ 下测光密度，以蒸 馏水为参比。另取 ２５ｍｇ 蛋白质，加水 ２５ｍｌ，振荡均 匀后过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测光密度 值。以相同体积样品的光密度之差与蛋白质含量做工 作曲线。结果见表 １。
表 １ 完全水解蛋白液与为水解蛋白液的吸光度之差
蛋白含量（ｍ ｇ ） ０．１ 吸光度之差 ０．１２９
０．２ ０．２９８
０．３ ０．３４３
０．４ ０．５１１
０．５ ０．５８４
０．６ ０．７０８
０．７ ０．８６４
０．８ １．０７１
作者简介：迟晓星（１９７６～ ），女，黑龙江大庆人，博士，讲师，主要从事营养与食品安全研究。
上。控制条件：最适酶底物浓度为 １４μｌ，ｐＨ值 ６．５，温 间的关系见表 ４。
度 ４５℃水浴中水解６ｈ，之后沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别
表 ４ ｐＨ 值与水解度之间的关系
取 １ｍｌ 测水解度。 ２．２．３ ｐＨ值对水解度的影响［７］ 分别配置ｐＨ值为 ６．５、７．０、７．５、８．０的大豆蛋白液。预处理同上。控制条
２００７ 年第 １ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．１，２００７
酶法水解大豆分离蛋白的研究
迟晓星 １，张 涛 ２，张园园 １
（１ 黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 １６３３１９；２ 哈尔滨医科大学分校，大庆 １６３０００）
摘 要：以大豆分离蛋白为原料，通过单因素试验和正交试验 Ｌ９（３４）研究了蛋白液的浓度、水解的温度、水 解时间、酶的加入量及ｐＨ值等因素对大豆分离蛋白水解度的影响，确定了适宜的范围值和因素组合。试验结果表明， 大豆分离蛋白在蛋白液浓度 ８％，加入的酶量为 １４μ ｌ，水解温度 ５０℃，水解时间６ｈ，ｐＨ值为 ６．５时水解率最高，水 解率可达到 １０．０％ 以上。
解度升高。当酶的用量超过１４μｌ以后，蛋白液的水解
Ａ
１００
ＤＨ（％）＝ × Ｖ１ × × １００
１０００ × Ｗ
Ｖ２
度又下降。这主要是因为由于酶浓度过大发生自溶（自 水解）现象，导致对底物水解作用减弱。所以酶的最佳
式中Ａ 为查表得蛋白质的ｍｇ 数；Ｗ 为称样重，ｇ ； 用量为１４μｌ。
的关系见表 ６。
表 ６ 时间与水解度之间的关系
蛋白重（ｇ） ０．８０１２
０．８０３５
０．８００８
０．８０１５
时间（ｈ）
４
５
６
７
吸光度
２．０４７
２．０９９
２．２５１
２．２６１
水解度（％ ） ９．７９
１０．３０
１０．８９
１０．９１
由表６可以看出，蛋白的水解率随着时间的延长而
增大。一般来讲，要达到同样的水解率，水解时间同
蛋白重（ｇ） ０．８０２１
０．８０１０
０．８００１
０．８０３５
温度（℃）
４０
４５
５０
５５
吸光度
２．０５４
２．０８８
２．２３３
２．０６９
水解度（％ ） ９．８４
１０．２５
１０．８５
９．９９
由表５可以看出，在５０℃时蛋白液的水解率最高，
３ 结果与讨论
故中性蛋白酶水解最适温度为５０℃。温度对酶促反应的 影响有两个方面，一是温度提高可使反应速度加快；二
３．１ 中性蛋白酶水解工艺条件的确定
是随着温度的提高，酶失活速度也开始加快。本试验使
３．１．１ 酶 ／ 底物浓度与水解度之间的关系 酶 ／ 底物 用ＨＨ－６数显恒温水浴锅温度，其恒定效果好，使数据
迟晓星等：酶法水解大豆分离蛋白的研究
３５
差距较小。
３．１．５ 时间与水解度之间的关系 时间与水解度之间
指标，对酶的用量、温度、时间及ｐＨ这４个因素（分别
以Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ表示）安排Ｌ９ （３４）正交试验，固定蛋
白液的浓度为８％，根据正交试验，计算极差（Ｒ）的大
小，可知道在设定的水平范围内各因素对试验指标的影
响程度，并确定最佳工艺，试验因素水平表见表７，蛋
白液水解的正交试验表见表８。
水平 Ｘ３ Ｒ
酶的用量 Ａ ９．６０ ０．５７
１ 材料与设备
１．１ 试验材料 大豆分离蛋白，哈尔滨生物制药有限公司；
Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶，哈尔滨生物制药有限公司；茚三 铜溶液，氯化亚锡，ｐＨ值为８的缓冲溶液，ｐＨ为７的磷 酸钠溶液，６Ｍ／１盐酸溶液，３６％的盐酸溶液，１Ｍ／１氢氧 化钠溶液，５％的氢氧化钠溶液。 １．２ 试验设备
ＨＨ－１数显恒温水浴锅，江苏荣华仪器制造有限公 司；７２２Ｓ分光光度计，上海分析仪器总厂；ＲＥ－５２ＡＡ旋 转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ｐＨＳ－３Ｃ精密计，上 海精密科学仪器有限公司；ＫＤＮ－０８Ｃ凯氏定氮仪，上海 新嘉电子有限公司；ＸＨＬ－１６Ｃ数控硝化炉，上海新嘉电 子有限公司；０．５－１０μｌ芬兰可调式移液器，上海累勃分
３４
中国食物与营养
２．１．４ 水解度的测定 取水解后灭酶的水解液１ｍｌ，稀 浓度与水解度之间的关系如表２。
释至 １００ｍｌ，过滤，取滤液 ２ｍｌ，加 ｐＨ 值 ８ 的缓冲溶液
表 ２ 酶底物的浓度与水解度之间的关系
０．５ｍｌ，茚三铜溶液 ０．５ｍｌ，沸水浴加热 １６ｍｉｎ，冷却， 用蒸馏水稀释至 ２５ｍｌ，在 ５７０ｎｍ 下测光密度，以蒸馏 水做参比。另取相同浓度未水解蛋白溶液 ２ｍｌ，按上述
１２
４５
４
１４
５０
５
１６
５５
６
ｐＨ Ｄ ６．６ ７．０ ７．５
水平
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ Ｘ１ Ｘ２
表 ８ 蛋白液水解正交试验表 Ｌ９（３４）
酶的用量 Ａ
温度 Ｂ 时间 Ｃ ｐＨ 水解率（％ ）
１
１
１
１
９．１５
１
２
２
２
１０．０２
１
３
３
３
９．４０
２
１
２
３
９．８３
２
２
３
１
蛋白重（ｇ）
０．４０３５
蛋白酶的加入量（μｌ） １０
吸光度
１．５１０
水解度（％ ）
８．０３
０．４０２７ １２
１．５９５ ９．５８
０．４０３３ １４
１．６３０ １０．５０
０．４０３４ １６
１．５５５ ８．８３
方法测光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白
由表２可以看出，随着酶用量的增大，蛋白液的水
质含量，按下式计算水解度：
１０．４５
２
３
１
２
９．９９
３
１
３
２
１０．１４
３
２
１
３
９．４５
３
３
２
１
９．２１
２８．５７
２９．１３
２８．５９ ２８．８１
３０．２７
２９．９２
２９．０６ ３０．１５
２８．８０
２８．６０
４ 结论
通过对Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶对大豆蛋白的水解条件 的探索，蛋白液水解时的浓度固定在８％时有利于水解的 进行。通过单因素实验和正交实验得出蛋白液的水解最 佳条件：蛋白液的浓度为８％、酶的加入量为１４μｌ、温 度为５０℃、时间为６ｈ、ｐＨ值为６．５。酶的加入量是蛋白液 水解的主要影响因素，其次是ｐＨ，Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶 在环境是中性的条件下水解作用最强。
白酶，控制ｐＨ值７．０。分别在４０℃、４５℃、５０℃、５５℃的水 ３．１．４ 温度与水解度之间的关系 温度与水解度之间
浴中加热水解６ｈ，之后在沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别取１ｍｌ 的关系见表 ５。
测水解度。
表 ５ 温度与水解度之间的关系
２．２．５ 时间对水解度的影响 配置溶液浓度为 ８％ 大豆 分离蛋白溶液。预处理同上。加入 １４ μｌ 的中性蛋白酶， 控制 ｐＨ值７．５，温度为 ５０℃。分别水解４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ， 之后在沸水浴中灭酶 ２０ｍｉｎ，分别取 １ｍｌ 测水解度。
４５℃水浴中水解６ｈ，之后沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别取 于酶作为一种特殊的蛋白质分子，其酶催化反应的能力
１ｍｌ测水解度。
与环境ｐＨ值密相关，环境ｐＨ值会影响酶分子的构像和酶
２．２．４ 温度对水解度的影响 配置溶液浓度为 ８％ 大豆分 分子及底物分子的解离状态，从而影响酶的活性和酶促
离蛋白溶液。预处理同上。控制条件：加入１４μｌ的中性蛋 反应速度，ｐＨ值过高、过低均对酶促反应不利。
Ｖ１为水解液的总体积，ｍｌ；Ｖ２为显色时所用稀释液的体 ３．１．２ 大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系 大豆
积，ｍｌ。
分离蛋白浓度与水解度之间的关系如表３。
２．２ 中性蛋白酶水解工艺的确定［６］
表 ３ 大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系
２．２．１ 酶 ／ 底物对水解度的影响 称取 ４ 份 ０．４ｇ 大豆 分离蛋白，分别加入ｐＨ值７．０磷酸钠溶液２０ｍｌ，在 ９５℃ 下处理 ２０ｍｉｎ，（以下的酶水解都在相应的温度下预处 理之后再加酶）。然后准确量取中性蛋白酶１０μｌ、１２ μｌ、
温度 Ｂ ９．５３ ０．４４
时间 Ｃ １０．００ ０．４７
（续）
ｐＨ 水解率（％ ） ９．５６ ０．４９
由表８结果可知，表中四个因素对蛋白液的水解度 影响的主次关系为Ａ ＞ Ｄ ＞ Ｃ ＞ Ｂ ，最佳因素组合为 Ａ２Ｄ２Ｃ３Ｂ２，即加入Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶１４μｌ，温度控制 在５０℃，水解时间为６ｈ，ｐＨ值为６．５，固定蛋白液的浓 度为８ ％ 时蛋白液的水解率最高。
酶的用量有关，酶的用量大，水解时间可以短些。加
酶量相同，时间越长，水解率越高，但达到一定的时
间后上升趋势减缓，综合考虑到能耗、生产周期及防
止水解液变质等因素，以水解时间不宜超过６ｈ为宜。
３．２ Ａ．Ｓ１３９８ 中性蛋白酶的水解蛋白液的最佳工艺条件
试验
在用中性蛋白酶水解蛋白液的过程中，为了确定蛋
白液的最佳水解条件，以蛋白液的水解率为实验的考察
蛋白重（ｇ） ｐ Ｈ 值（Ｄ ） 吸光度 水解度（％ ）
０．８０２ ６．５ ２．０８８ １０．１５
０．７９９９ ７．０
２．１９９ １０．７３
０．８０３８ ７．５ ２．０３４ ９．６９
０．８０１２ ８．０ ２．０２１ ９．５９
件：酶／底物浓度１４μｌ，大豆分离蛋白浓度８％，温度为
由表４可以看出，ｐＨ值为７．０时水解度最大。这是由
关键词：大豆分离蛋白；中性蛋白酶；水解
将大豆蛋白质水解可以改善大豆蛋白质的品质，提 高营养价值，进一步改善其溶解性、起泡性等功能特 性，促进大豆蛋白在食品工业中的应用［１，２］。与酸法和 碱法相比，酶法水解大豆蛋白水解效率高，反应条件温 和，产生毒性物质的可能性较小；同时随着酶反应的进 行，蛋白质的分子量逐渐变小，并转化为肽或者氨基酸， 其物理性状及机能特性都发生明显变化，在营养学上比蛋 白质和氨基酸具有更多的优点［３～５］。
蛋白重（ｇ）
０．４０３５
０．６０２４ ０．８０１０ １．１００９
蛋白液的浓度（％ ） ４
６
８
１０
吸光度
Leabharlann Baidu１．６１５
１．７５９
２．１３３
１．６５０
水解度（％ ）
９．３５
９．６３
１０．７０
８．３６
由表３可以看出，随着蛋白液浓度的增大，蛋白液的
１４ μｌ、１６μｌ 分别加入。ｐＨ值 ６．５，４５℃水浴中水解６ｈ， 水解率呈上升趋势，浓度为８％时的水解率较大。随着浓
表 ７ 蛋白液水解因素水平表
水平 １ ２ ３
加入酶量 Ａ（μ ｌ） 温度 Ｂ（℃） 时间 Ｃ（ｈ）
之后沸水浴中灭酶活 ２０ｍｉｎ，分别取 １ｍｌ 测水解度。
度的继续增大水解率呈下降趋势，说明蛋白液的浓度增
００００００００００００
２．２．２ 大豆分离蛋白浓度对水解度的影响 分别配置 大，导致酶底物浓度低，酶促反应速度下降，水解下降。
浓度为 ４％、６％、８％、１０％ 的大豆蛋白溶液。预处理同 ３．１．３ ｐＨ 值与水解度之间的关系 ｐＨ 值与水解度之
析仪器有限公司；Ｆ Ａ （Ｎ ）Ａ （Ｎ ）系列电子天平，上 海民桥精密科学仪器有限公司。
２ 方法
２．１ 分析方法 样品总氮的测定方法采用ＧＢ６４３２—８６，大豆分离
蛋白的水解度选用分光光度法。 ２．１．１ 大豆蛋白水解的测定 大豆蛋白水解的测定采 用校正后的茚三铜比色法即利用水解原料的完全水解液 作为标准，使结果更接近真实值。 ２．１．２ 完全水解蛋白液的制备 取大豆蛋白２５ｍｇ，放 入反应瓶中加入 ２５ｍｇ６Ｍ 盐酸，拧紧瓶盖，１００℃水解 ２４ｈ，冷却，过滤，滤液旋转蒸发器浓缩至 ０．５ｍｌ 左右， 加蒸馏水，用 １ＭＮａＯＨ 中和至中性（ｐＨ 值 ６），定容至 ２５ｍｌ。 ２．１．３ 工作曲线的绘制 取完全水解液０．１～０．８ｍｌ于 ２５ｍｌ 比色管中，蒸馏水稀释至 ２ｍｌ，加 ｐＨ 值为 ８ 的缓 冲溶液 ０．５ｍｌ，茚三铜溶液 ０．５ｍｌ，沸水浴加热 １６ｍｉｎ， 冷却，蒸馏水稀释至 ２５ｍｌ。５７０ｎｍ 下测光密度，以蒸 馏水为参比。另取 ２５ｍｇ 蛋白质，加水 ２５ｍｌ，振荡均 匀后过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测光密度 值。以相同体积样品的光密度之差与蛋白质含量做工 作曲线。结果见表 １。
表 １ 完全水解蛋白液与为水解蛋白液的吸光度之差
蛋白含量（ｍ ｇ ） ０．１ 吸光度之差 ０．１２９
０．２ ０．２９８
０．３ ０．３４３
０．４ ０．５１１
０．５ ０．５８４
０．６ ０．７０８
０．７ ０．８６４
０．８ １．０７１
作者简介：迟晓星（１９７６～ ），女，黑龙江大庆人，博士，讲师，主要从事营养与食品安全研究。
上。控制条件：最适酶底物浓度为 １４μｌ，ｐＨ值 ６．５，温 间的关系见表 ４。
度 ４５℃水浴中水解６ｈ，之后沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别
表 ４ ｐＨ 值与水解度之间的关系
取 １ｍｌ 测水解度。 ２．２．３ ｐＨ值对水解度的影响［７］ 分别配置ｐＨ值为 ６．５、７．０、７．５、８．０的大豆蛋白液。预处理同上。控制条
２００７ 年第 １ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．１，２００７
酶法水解大豆分离蛋白的研究
迟晓星 １，张 涛 ２，张园园 １
（１ 黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 １６３３１９；２ 哈尔滨医科大学分校，大庆 １６３０００）
摘 要：以大豆分离蛋白为原料，通过单因素试验和正交试验 Ｌ９（３４）研究了蛋白液的浓度、水解的温度、水 解时间、酶的加入量及ｐＨ值等因素对大豆分离蛋白水解度的影响，确定了适宜的范围值和因素组合。试验结果表明， 大豆分离蛋白在蛋白液浓度 ８％，加入的酶量为 １４μ ｌ，水解温度 ５０℃，水解时间６ｈ，ｐＨ值为 ６．５时水解率最高，水 解率可达到 １０．０％ 以上。
解度升高。当酶的用量超过１４μｌ以后，蛋白液的水解
Ａ
１００
ＤＨ（％）＝ × Ｖ１ × × １００
１０００ × Ｗ
Ｖ２
度又下降。这主要是因为由于酶浓度过大发生自溶（自 水解）现象，导致对底物水解作用减弱。所以酶的最佳
式中Ａ 为查表得蛋白质的ｍｇ 数；Ｗ 为称样重，ｇ ； 用量为１４μｌ。
的关系见表 ６。
表 ６ 时间与水解度之间的关系
蛋白重（ｇ） ０．８０１２
０．８０３５
０．８００８
０．８０１５
时间（ｈ）
４
５
６
７
吸光度
２．０４７
２．０９９
２．２５１
２．２６１
水解度（％ ） ９．７９
１０．３０
１０．８９
１０．９１
由表６可以看出，蛋白的水解率随着时间的延长而
增大。一般来讲，要达到同样的水解率，水解时间同
蛋白重（ｇ） ０．８０２１
０．８０１０
０．８００１
０．８０３５
温度（℃）
４０
４５
５０
５５
吸光度
２．０５４
２．０８８
２．２３３
２．０６９
水解度（％ ） ９．８４
１０．２５
１０．８５
９．９９
由表５可以看出，在５０℃时蛋白液的水解率最高，
３ 结果与讨论
故中性蛋白酶水解最适温度为５０℃。温度对酶促反应的 影响有两个方面，一是温度提高可使反应速度加快；二
３．１ 中性蛋白酶水解工艺条件的确定
是随着温度的提高，酶失活速度也开始加快。本试验使
３．１．１ 酶 ／ 底物浓度与水解度之间的关系 酶 ／ 底物 用ＨＨ－６数显恒温水浴锅温度，其恒定效果好，使数据
迟晓星等：酶法水解大豆分离蛋白的研究
３５
差距较小。
３．１．５ 时间与水解度之间的关系 时间与水解度之间
指标，对酶的用量、温度、时间及ｐＨ这４个因素（分别
以Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ表示）安排Ｌ９ （３４）正交试验，固定蛋
白液的浓度为８％，根据正交试验，计算极差（Ｒ）的大
小，可知道在设定的水平范围内各因素对试验指标的影
响程度，并确定最佳工艺，试验因素水平表见表７，蛋
白液水解的正交试验表见表８。
水平 Ｘ３ Ｒ
酶的用量 Ａ ９．６０ ０．５７
１ 材料与设备
１．１ 试验材料 大豆分离蛋白，哈尔滨生物制药有限公司；
Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶，哈尔滨生物制药有限公司；茚三 铜溶液，氯化亚锡，ｐＨ值为８的缓冲溶液，ｐＨ为７的磷 酸钠溶液，６Ｍ／１盐酸溶液，３６％的盐酸溶液，１Ｍ／１氢氧 化钠溶液，５％的氢氧化钠溶液。 １．２ 试验设备
ＨＨ－１数显恒温水浴锅，江苏荣华仪器制造有限公 司；７２２Ｓ分光光度计，上海分析仪器总厂；ＲＥ－５２ＡＡ旋 转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ｐＨＳ－３Ｃ精密计，上 海精密科学仪器有限公司；ＫＤＮ－０８Ｃ凯氏定氮仪，上海 新嘉电子有限公司；ＸＨＬ－１６Ｃ数控硝化炉，上海新嘉电 子有限公司；０．５－１０μｌ芬兰可调式移液器，上海累勃分
３４
中国食物与营养
２．１．４ 水解度的测定 取水解后灭酶的水解液１ｍｌ，稀 浓度与水解度之间的关系如表２。
释至 １００ｍｌ，过滤，取滤液 ２ｍｌ，加 ｐＨ 值 ８ 的缓冲溶液
表 ２ 酶底物的浓度与水解度之间的关系
０．５ｍｌ，茚三铜溶液 ０．５ｍｌ，沸水浴加热 １６ｍｉｎ，冷却， 用蒸馏水稀释至 ２５ｍｌ，在 ５７０ｎｍ 下测光密度，以蒸馏 水做参比。另取相同浓度未水解蛋白溶液 ２ｍｌ，按上述
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ｐＨ Ｄ ６．６ ７．０ ７．５
水平
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｔ１ Ｔ２ Ｔ３ Ｘ１ Ｘ２
表 ８ 蛋白液水解正交试验表 Ｌ９（３４）
酶的用量 Ａ
温度 Ｂ 时间 Ｃ ｐＨ 水解率（％ ）
１
１
１
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９．１５
１
２
２
２
１０．０２
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３
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蛋白重（ｇ）
０．４０３５
蛋白酶的加入量（μｌ） １０
吸光度
１．５１０
水解度（％ ）
８．０３
０．４０２７ １２
１．５９５ ９．５８
０．４０３３ １４
１．６３０ １０．５０
０．４０３４ １６
１．５５５ ８．８３
方法测光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白
由表２可以看出，随着酶用量的增大，蛋白液的水
质含量，按下式计算水解度：
１０．４５
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９．４５
３
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１
９．２１
２８．５７
２９．１３
２８．５９ ２８．８１
３０．２７
２９．９２
２９．０６ ３０．１５
２８．８０
２８．６０
４ 结论
通过对Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶对大豆蛋白的水解条件 的探索，蛋白液水解时的浓度固定在８％时有利于水解的 进行。通过单因素实验和正交实验得出蛋白液的水解最 佳条件：蛋白液的浓度为８％、酶的加入量为１４μｌ、温 度为５０℃、时间为６ｈ、ｐＨ值为６．５。酶的加入量是蛋白液 水解的主要影响因素，其次是ｐＨ，Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶 在环境是中性的条件下水解作用最强。
白酶，控制ｐＨ值７．０。分别在４０℃、４５℃、５０℃、５５℃的水 ３．１．４ 温度与水解度之间的关系 温度与水解度之间
浴中加热水解６ｈ，之后在沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别取１ｍｌ 的关系见表 ５。
测水解度。
表 ５ 温度与水解度之间的关系
２．２．５ 时间对水解度的影响 配置溶液浓度为 ８％ 大豆 分离蛋白溶液。预处理同上。加入 １４ μｌ 的中性蛋白酶， 控制 ｐＨ值７．５，温度为 ５０℃。分别水解４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ， 之后在沸水浴中灭酶 ２０ｍｉｎ，分别取 １ｍｌ 测水解度。
４５℃水浴中水解６ｈ，之后沸水浴中灭酶２０ｍｉｎ，分别取 于酶作为一种特殊的蛋白质分子，其酶催化反应的能力
１ｍｌ测水解度。
与环境ｐＨ值密相关，环境ｐＨ值会影响酶分子的构像和酶
２．２．４ 温度对水解度的影响 配置溶液浓度为 ８％ 大豆分 分子及底物分子的解离状态，从而影响酶的活性和酶促
离蛋白溶液。预处理同上。控制条件：加入１４μｌ的中性蛋 反应速度，ｐＨ值过高、过低均对酶促反应不利。
Ｖ１为水解液的总体积，ｍｌ；Ｖ２为显色时所用稀释液的体 ３．１．２ 大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系 大豆
积，ｍｌ。
分离蛋白浓度与水解度之间的关系如表３。
２．２ 中性蛋白酶水解工艺的确定［６］
表 ３ 大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系
２．２．１ 酶 ／ 底物对水解度的影响 称取 ４ 份 ０．４ｇ 大豆 分离蛋白，分别加入ｐＨ值７．０磷酸钠溶液２０ｍｌ，在 ９５℃ 下处理 ２０ｍｉｎ，（以下的酶水解都在相应的温度下预处 理之后再加酶）。然后准确量取中性蛋白酶１０μｌ、１２ μｌ、
温度 Ｂ ９．５３ ０．４４
时间 Ｃ １０．００ ０．４７
（续）
ｐＨ 水解率（％ ） ９．５６ ０．４９
由表８结果可知，表中四个因素对蛋白液的水解度 影响的主次关系为Ａ ＞ Ｄ ＞ Ｃ ＞ Ｂ ，最佳因素组合为 Ａ２Ｄ２Ｃ３Ｂ２，即加入Ａ．Ｓ１３９８中性蛋白酶１４μｌ，温度控制 在５０℃，水解时间为６ｈ，ｐＨ值为６．５，固定蛋白液的浓 度为８ ％ 时蛋白液的水解率最高。
酶的用量有关，酶的用量大，水解时间可以短些。加
酶量相同，时间越长，水解率越高，但达到一定的时
间后上升趋势减缓，综合考虑到能耗、生产周期及防
止水解液变质等因素，以水解时间不宜超过６ｈ为宜。
３．２ Ａ．Ｓ１３９８ 中性蛋白酶的水解蛋白液的最佳工艺条件
试验
在用中性蛋白酶水解蛋白液的过程中，为了确定蛋
白液的最佳水解条件，以蛋白液的水解率为实验的考察
蛋白重（ｇ） ｐ Ｈ 值（Ｄ ） 吸光度 水解度（％ ）
０．８０２ ６．５ ２．０８８ １０．１５
０．７９９９ ７．０
２．１９９ １０．７３
０．８０３８ ７．５ ２．０３４ ９．６９
０．８０１２ ８．０ ２．０２１ ９．５９
件：酶／底物浓度１４μｌ，大豆分离蛋白浓度８％，温度为
由表４可以看出，ｐＨ值为７．０时水解度最大。这是由
关键词：大豆分离蛋白；中性蛋白酶；水解
将大豆蛋白质水解可以改善大豆蛋白质的品质，提 高营养价值，进一步改善其溶解性、起泡性等功能特 性，促进大豆蛋白在食品工业中的应用［１，２］。与酸法和 碱法相比，酶法水解大豆蛋白水解效率高，反应条件温 和，产生毒性物质的可能性较小；同时随着酶反应的进 行，蛋白质的分子量逐渐变小，并转化为肽或者氨基酸， 其物理性状及机能特性都发生明显变化，在营养学上比蛋 白质和氨基酸具有更多的优点［３～５］。
蛋白重（ｇ）
０．４０３５
０．６０２４ ０．８０１０ １．１００９
蛋白液的浓度（％ ） ４
６
８
１０
吸光度
Leabharlann Baidu１．６１５
１．７５９
２．１３３
１．６５０
水解度（％ ）
９．３５
９．６３
１０．７０
８．３６
由表３可以看出，随着蛋白液浓度的增大，蛋白液的
１４ μｌ、１６μｌ 分别加入。ｐＨ值 ６．５，４５℃水浴中水解６ｈ， 水解率呈上升趋势，浓度为８％时的水解率较大。随着浓