菌种的保藏方法

枯、菌体自溶。
• 解决方法：减少培养基营养、密封、减少接菌量。
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穿刺保藏法
• 操作：将菌种穿刺接种于半固体培养基上，然后覆盖2－3mm的
液体石蜡，放入冰箱4℃保藏。一方面可防止因培养基水分蒸发
而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 • 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不 死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。 特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢
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3 菌种保藏的原理和方法
• • • • • • • 斜面保藏法 穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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菌种保藏的原理
• 根据微生物的生理生化特性，人为地创 造条件，使微生物处于代谢不活跃、生 长繁殖受抑制的休眠状态，以减少菌种 的变异。菌种保藏的基本措施是寡营养、 低温、干燥、真空。
甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰
箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活 力不受影响。
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液氮冷冻保藏技术
冷冻保护剂
最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，
最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。
所使用的甘油 — 般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚
砜最好为过滤灭菌。
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基因工程菌的保藏
• 由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、
且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞
生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速 度会加快。
• 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质
粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工 程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染 色体复制的协调。 • 建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
日本东京大学应用微生物研究所， 日本东京
4、IFO (Institute for Fermentation, Osaka) 发酵研究所，日本大阪
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5、普通微生物菌种保藏管理中心 （CCGMC ） 中科院微生物所，北京 6、工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)
轻工部食品发酵工业科学研究所，北京
• 加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的
稳定性。在一个给定温度下通过对高温下短期活力 丧失程度检测，预测菌种的稳定性。 • 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保 藏 6 个月、 1 年或更长时间后存活百分率 ( 或存活单 位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征 应在菌种保藏前后保持同一性。
1、ATCC (American Type Culture Collection)
美国标准菌种收藏所， 马里兰州，罗克维尔市
2、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory) 冷泉港研究室， 美国 3、IAM (Institute of Applied Microbiology,University of Tokyo)
• 适用于丝状真菌、酵母及肠道科细菌，在10 ℃
或室温下保藏比低温效果好。
• 一般可保藏一年或更长。
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低温保藏法(-20℃)
• 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到 试管内，然后贮藏于温度范围在 -5 ～ -20 ℃的普通 冰箱 (-20 ℃ ) 中。或者，将菌种培养在小的试管或
培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡
以下进行保藏。
• 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1 ．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
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4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超
低温冰箱中保藏。
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• 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％
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理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1)经长期保藏后菌种存活健在。
(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是
不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高
产能力。 (3) 简便、经济，可广泛使用。
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斜面保藏法
• 是一种短期的保藏方法，广泛适用于细菌、放线菌、酵母、 丝状真菌等的短期保藏。 • 操作方法：斜面培养生长良好后，放入4℃冰箱（视菌种而 异），一般可保存3-6个月。 • 缺点：保藏时间短，需经常传代，易变异、污染、培养基干
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1、斜面冰箱保藏法
2、沙土管保藏法 3、菌丝速冻法 4、石蜡油封存法
4 C ； 3-6个月
产孢子或芽孢微生物，1年 甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 C 1年左右 任何微生物；一般5年以上
5、真空冷冻干燥保藏法
6、液氮超低温保藏法
-196 C ；保护剂；保存期长
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国内外重要菌种保藏机构
胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。
• 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
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• 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用
来保藏。
• 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管
应严格密封。
• 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长
期保藏。
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超低温保藏技术(-60∼-80℃)
• 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在 -60 ℃
子的担子菌等的保藏更为有效。此法的优点是制作简单，不需
特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所 占位置较大，同时也不便携带。
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• 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜
的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的
矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。
• 以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株 预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还 十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液 体石蜡。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。 为了预防不测，一般保藏株 2 ～ 3 年也应做一次存 活试验。
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沙土管干燥保藏法
• 适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形
成芽孢的细菌。
• 原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。 • 因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦 好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效 果不佳。
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真空冷冻干燥保藏法
• 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻
结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法
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微生物活力和稳定性测定
• 在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的
保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保
藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
• 对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态
学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特 征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
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是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。
• 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常
用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 • 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久 而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻 保藏，便于运输。
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悬液保藏法
• 基本原理是寡营养保藏，将微生物悬浮在不含 养分的溶液中，如蒸馏水、磷酸缓冲液或生理 盐水中。注意密封性。