朊病毒及其致病机理研究进展

朊病毒及其致病机理研究进展
摘要：朊病毒是有侵染性的蛋白颗粒，是造成人类及其它动物的多种致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患的元凶，它不含有核酸，因而其生物学结构及特性、复制及致病机理具有特殊性，这也为朊病毒的鉴别提供了标准。

此外，值得注意的是，朊病毒的遗传也具有多样性，这造成了朊病毒在不同宿主间的传播障碍。

本文将针对上述问题，对朊病毒及其致病机理研究进展进行简要的介绍。

关键词：朊病毒
人类早在18世纪就发现了由朊病毒引起的致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患[1]，但却一直无法分离出朊病毒病原。

这是因为朊病毒不含有核酸和脂类，是纯粹的“有侵染性的疏水性蛋白颗粒”[2]。

直到1982年，美国加州大学神经病学教授Prusiner在对绵羊瘙痒病因子的研究中，才第一次揭开其神秘的面纱[3]。

朊病毒的发现，无疑使人类对生命体的认识，达到了一种新的高度——不具有核酸却能复制的朊病毒是否属于生物的范畴，至今仍处在激烈的争论之中。

现在，就让我们一起来认识这一特殊的存在。

1.生物学结构及特性
朊病毒是由朊病毒蛋白(prion protein，PrP)组成的，是具有传染性的结构简单的糖蛋白，其分子量为27000～30000Da[4]，在电镜下看不见其病原颗粒。

朊病毒蛋白的前体(cellular isoform of the prion protein，PrP C)，是一种正常无害的蛋白质，是由宿主细胞一条染色体上的一个基因产生的，多数存在于神经元中，能通过空间构象变化形成感染形式的朊病毒蛋白前体(scrapie isoform of the prion protein，PrP Sc)。

PrP Sc 再经蛋白酶的酶切作用可转化为具有侵染性的PrP27～30，最后通过纤维聚合自我成核作用，形成朊病毒蛋白。

PrP27～30的浓度与其传染性成正比，经化学灭活处理后，其活性与传染性将同步下降。

1.1.理化性质
由于朊病毒是纯粹的疏水性蛋白颗粒，因此能抵抗多种核酸酶（包括RNA酶和DNA酶）的作用，但却可被胰蛋白酶降解，蛋白质变性剂或氨基酸化学修饰剂也对其具有灭活或抑制作用。

它耐高温，能抵抗254nm紫外线的照射，但对237nm紫外线表现敏感[5]，同时能抵抗离子辐射和超声波。

一般的化学消毒剂对其无破坏作用。

1.2.生化特性
由于朊病毒不具有遗传信息载体——核酸，不能像病毒一样通过逆转录，利用宿主细胞物质合成自身所需物质，因此，它不能形成包涵体，不能产生干扰素，也对干扰素不敏感，同时不能干扰其他病毒产生干扰素。

它不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能，也不会引起宿主的免疫反应。

免疫增强剂和免疫抑制剂均不能改变其致病过程。

在温和的清洁提取物中纤维状或短杆状朊病毒会大量聚合，表明其在非变性去污剂中不溶。

朊病毒只以单体或是二聚体形式存在，所以用核磁共振（NMR）和X光谱分析不能辨别其构象[6]。

此外，由于朊病毒依赖于磷酸肌醇磷脂酶作为结合位点（GPI）附着在细胞表面，因此经过磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，朊病毒不会从膜上被释放[7]。

1.3.基因结构
PrP基因为单一基因，人、哺乳动物和禽类都具有该基因。

人类朊病毒蛋白(PrP)基因定位于20号染色体，小鼠则定位于2号染色体[8]并与控制朊病毒潜伏期的基因(Prn-i)相连
构成复合物。

在酵母及果蝇、线虫等无脊椎动物的基因组中也检测到PrP基因。

由PrP基因转录所得的PrPmRNA可在成年动物脑中表达，但可在动物的发育过程中被调节，以神经元的含量为最高，因此，朊病毒病通常出现于中枢神经系统。

1.3.1.PrP基因的结构
PrP基因的5’端是由52～82bp组成的非编码外显子，3’端是2kb的编码外显子，中间被10kb的内含子分隔开。

由于编码序列仅限于一个外显子，因此，可以排除因转录水平的拼接上的不同而造成PrP存在两种不同异构体的可能性[9]。

此外，其启动子区域没有常规的“TATA”盒，而含有“GCCCCGCCC”3个重复序列，与管家(house keeping)基因的结构十分相似[8]。

PrP基因的翻译起始于起始密码子ATG的上游第42bp处[9]。

现今已经发现人类PrP有20余种基因突变可引起人类遗传性的朊病毒病，并已确定其中5种具有重要意义的遗传连锁，从中可知突变所产生的氨基酸替代大都出现在PrP C的4个 螺旋区(H1～H4)附近。

该替代会导致PrP C失稳，并促使PrP C自发产生构型转变而生成较为稳定的PrP Sc[9]。

1.3.
2.PrP C的一级结构
PrP C全长为253～264个氨基酸，分子质量为33～35KD[10]，其N-端的22个疏水氨基酸残基为信号肽序列，C-端的23个疏水氨基酸残基是糖基磷酸肌醇的结合位点（GPI），用于附着在宿主细胞表面。

其中从N-端数起的23～95位氨基酸残基之间有一个富含组氨酸和甘氨酸的八肽重复区（PHGGGWGO），96～112位氨基酸序列是PrP的结构控制区，113～135位有一段跨膜区，135～231位之间是3个束状螺旋区域[11]。

成熟的PrP分子有两个N型糖基化位点，即181、197位的两个天冬酰胺（Asn）残基。

在179、214位的两个半胱氨酸（Cys）残基之间还有一个二硫键，这是PrP C中唯一的二硫键，而145位的酪氨酸（Tyr）也被硫化。

183、192位的2个苏氨酸（Thr）的磷酸化序列一致，155位的酪氨酸是其磷酸化位点之一。

此外，147～163位的氨基酸之间还有一芳烃回文序列[6]。

PrP C共含有3组不同的短肽重复结构：第一组为6肽；第二组为8肽（PHGGGWGQ）；第三组为2肽的串联结构，与上述的芳烃回文序列部分重合[12]，是PrP C的独有结构。

1.3.3.PrP C的高级结构
PrP C的N-端存在着缺乏有序结构的高柔顺度的片段，可在溶液中随意摆动；C-端含有3个α-螺旋，2个反向平行的β-折叠及一个二硫键[13]，还具有多处被糖基化、磷酸化、硫基化等化学修饰的氨基酸位点，自折叠成一个球状结构区域。

由于PrP C属于自折叠单位而不需要特定的蛋白酶辅助折叠，为其突变体PrP Sc也通过自折叠成型通过了可能。

1.3.4.PrP Sc的高级结构
PrP Sc中含有43%的β-折叠和30%的α-螺旋，在PrP C的构象改变过程中，二硫键保持完好，主要的转变部位在90～112位的氨基酸残基间[14]，这里的α-螺旋转变为β-螺旋，二维结晶结构呈六边形，N-端的β-螺旋位于六角单元内，与位于边上的第二α螺旋、第三α螺旋及位于单元间的糖基相对称[15]，以稳定突变形成的PrP Sc的立体结构。

2.朊病毒的致病机理
朊病毒的致病过程主要分为五个阶段：
2.1.PrP Sc的形成
PrP Sc是由PrP C经过构象转变而形成的，这一过程目前主要有两种模型：
2.1.1.重折叠模型
通常，PrP C作为许多动物体正常代谢的一部分，在体内不断的合成、降解，但因其结构的随机不稳定性，时而会产生极少数未折叠的单体结构PrP*，成为形成PrP Sc的中间体。

PrP*既能形成两种不同构象的PrP蛋白--PrP C和PrP Sc，也能与细胞内已存在的PrP Sc先形成暂时性的复合物（PrP*／PrP Sc），然后再转化为两分子的PrP Sc，最终使PrP Sc呈指数性增长。

在正常情况下，PrP*的浓度很低，因此，PrP Sc的形成可忽略不计。

但当出现以下三种情况时，PrP Sc就会大量地产生和积蓄：
①外源朊病毒进入细胞并作为PrP Sc模板，促使PrP*通过上述两种方式转变为PrP Sc；
②在外源朊病毒参与时，PrP*积蓄至足以自发产生PrP Sc的水平，并通过正反馈环道或者体细胞突变令PrP C失稳，促使更多的PrP*生成并转变为PrP Sc[16]；
③由突变的PrP基因转录产生的△PrP C作为细胞正常代谢的一部分而被合成和降解。

但由于△PrP C的随机不稳定性比PrP C高，能自发地产生少部分的解折叠的单体结构——△PrP C，它能重新折叠为△PrP C而被降解，也可转变为△PrP Sc并通过正反馈环道促使更多的△PrP C转变为△PrP Sc[17]。

2.1.2.种子模型
以低分子量的PrP Sc聚合物充当种子。

当没有种子时，PrP C和PrP Sc单体间会发生快速的可逆构象变化，由于正常的PrP C单体构象比PrP Sc稳定，因此PrP C占主要组分；但当种子存在时，PrP C可通过与PrP Sc单体结合形成构象稳定的复合物，支持了PrP Sc的稳定存在，加速了PrP C转变为PrP Sc，而且由于该复合物比单独的PrP Sc更稳定，该转变不可逆[18]。

2.2.PrP Sc的复制。

由于朊病毒不含有自身复制的基因材料,PrP Sc在产生后或者作为外源物入侵机体后，需要利用机体原有的蛋白质来复制自身，以产生更多的PrP Sc，其机制目前存在两种可能：2.2.1.模板依赖形式[9]
PrP C的存在有两种形式：一种是游离形式，即以具有 螺旋并对蛋白敏感的单体形式存在；另一种是结合形式，借PrP C羧基端与蛋白质（标记为蛋白X）结合，同时导致PrP C 的构象发生改变，标记为PrP·。

在正常情况下，PrP C的两种形式处于平衡状态。

但有PrP Sc模板存在时，PrP Sc单体可与PrP·-蛋白X复合物中PrP·的氨基端结合，产生具有复制能力的复合物PrP Sc/PrP·-蛋白X，使PrP·可以以PrP Sc为模板，转变为PrP Sc并生成PrP Sc二聚体，同时释放出来的蛋白X能继续与PrP C结合形成PrP·-蛋白X 复合物。

PrP Sc二聚体一部分可分解为非感染性的单体，进一步与PrP·-蛋白X结合并使PrP·转变成PrP Sc分子；而大部分则积聚在一起，造成潜伏期朊病毒滴度不断上升。

2.2.2.成核-聚合形式[4]
一个PrP Sc可以与一个PrP C分子结合产生一个PrP C-PrP Sc异二聚体(het-erodimer)，然后该异二聚体转化形成2个PrP Sc分子，在下一次循环中结合2个PrP C分子，形成可与4个PrP C结合的4个PrP Sc分子，它们再结合4个PrP C分子，不断恶性循环，最终使朊病
毒的数量呈指数式增长。

2.3.PrP Sc由细胞大量产生后，由于具有有限的抗蛋白酶的能力而能在蛋白酶数量相对较少的细胞表面积累[6]。

2.4.ctm PrP的生成
PrP C在运输到细胞膜前，在跨越内质网膜时，可形成三种拓扑结构不同的蛋白质——sec PrP、rdm PrP和ctm PrP，其中sec PrP以GPI锚镶嵌于内质网内侧膜上，而rdm PrP和ctm PrP分别以N端和C端穿越内质网膜[19]。

在正常的野生型PrP生物合成过程中，rdm PrP和ctm PrP的合成量很少，但一旦PrP基因产生突变，ctm PrP表达量将显著增加，而且PrP Sc的积累也会增加ctm PrP的合成[6]。

2.5.ctm PrP在内质网上成熟后，释放出神经元细胞外，可侵害神经系统[6]，导致大脑皮质的神经元细胞退化、空泡变性、死亡、消失，被星状细胞取代，神经胶质增生，细胞外淀粉样变性蛋白质沉积，大脑皮质变薄而白质相对增加，造成海绵状态。

3.鉴别朊病毒的三项遗传标准[20]
根据上述的朊病毒致病机理，我们不难发现由朊病毒特殊的产生及复制过程所造成的朊病毒遗传及致病上的特点。

依此，人们可鉴别出朊病毒。

3.1.可逆的治愈性(Reversible Curdility)
即如果朊病毒可被治愈，它应能在治愈的品系内再次以低频率发生。

这是因为突变后产生朊病毒的PrP基因是动物体内本身所具有的，用于通过构象改变而形成朊病毒的PrP C
也是动物体内的一种正常蛋白，只要一旦有PrP Sc模板出现，就机会再次患病。

3.2.正常蛋白的过剩生产将加大朊病毒形成的频率(0verprduction of the Nonnal Protein Increase the Frequency of Prion Fomation)
这是因为朊病毒形成的原发事件是蛋白的自发转变，所以该蛋白正常形式的过剩生产会加大作为此种转变的后选分子的数量。

3.3.蛋白的基因突变与其朊病毒的表型相关(Phenotype Relationship of Prion and Mutation of the Gene for the Protein)
因为朊病毒的繁殖是通过正常形式的蛋白的转变的，所以PrP基因突变能阻止正常蛋白的合成，即阻止朊病毒繁殖。

可将该蛋白的染色体基因视为该非孟德尔因子（朊病毒）繁殖所必需的基因，其突变体的表型与该非孟德尔因子的现象型是一致的，不管是该朊病毒的存在还是该基因突变的存在都能导致出现同样的表型，即缺乏正常蛋白。

4.朊病毒遗传的多样性[7]
由于朊病毒繁殖的信息是贮存在致病蛋白PrP Sc的构象中，因此具有不同蛋白构象的不同株系所引起的临床表现及稳定性、PrP Sc免疫印记图谱、抵热能力等也不尽相同，这就是朊病毒遗传的多样性。

该多样性起源于合成不同毒株的神经元不同。

虽然不同神经元亚群间合成的PrP C同型且一级结构相同，但其二级结构不同。

而PrP Sc促使PrP C转变为新生PrP Sc的过程只发生于能合成与其相容的PrP C的神经元内，最终导致可出现多种二级结构不同的PrP Sc。

此外，PrP C 糖化上的差异可能也和毒株的多样性相关（Giese，1998），能PrP分子具有400种以上的不同形式。

5.朊病毒的种间障碍[7]
朊病毒种间障碍是指一个物种对另一物种的朊病毒感染具有抵抗力的现象（Viles，1999），表现为新宿主体内合成的朊病毒的序列与新宿主PrP基因相同，而非接种物中PrP Sc
的序列。

当朊病毒继续在同源宿主中传代时其潜伏期将缩短，并在几代后出现稳定，即在PrP Sc的繁殖过程中存在朊病毒的种属及株系的特异性，同时，其潜育期延长甚至不发病。

造成朊病毒种间障碍的根本原因在于不同朊病毒的氨基酸一级结构间存在差异，造成了三维构象上的不同。

朊病毒的种间障碍体现出朊病毒遗传的多样性。

6.结语
虽然，目前朊病毒只有一种蛋白类型——PrP Sc，但其出现到底是偶然的基因突变，还是预示着一种致病蛋白的产生机制？而只具有蛋白质，不具有核酸却能复制的朊病毒又是否会构成一类新的物种？同时，由于人类及其它动物的多种致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患都是由朊病毒所引起的，能否找到预防及根治朊病毒病的方法关系着人类的生活及生产？这一系列问题的解决都依赖于人类的朊病毒及其致病机理认识的加深。

相信，随着科学技术的发展，随着人类对朊病毒及其致病机理研究的进展，人类将最终克服朊病毒的发现所带来的难题。

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