第二章 生物技术常用的工具酶

基因工程操作中最常用的工具酶
酶（合成）
DNA连接酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Taq DNA 聚合酶 逆转录酶
酶（降解）
限制性核酸内切酶 S1核酸酶 DNA酶Ⅰ RNA酶 A
Klenow酶(补平); 末端转移酶; 核酸修饰酶 多核苷酸激酶; 碱性磷酸酶
§1 限制性核酸内切酶 (Restriction Endonuclease)
修饰实现的。
限制性核酸内切酶：简称限制酶，能识别并切断外来
DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来
噬菌体的繁殖，这类酶称为限制酶。 修饰酶：不仅能识别限制酶所识别的序列，且能把其
中某些胞嘧啶或腺嘌呤甲基化，使其不再被限制酶降解，
这类酶称为修饰酶。
Sau3AI：
5’--- G A T C ---3’ 3’--- C T A G ---5’
Sau3AI的酶切位点为GATC，但胞嘧啶“C”被甲 基化（修饰）后，Sau3AI的内切酶活性即被抑制。
二、限制酶的分类
• 根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性 等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。I类和Ⅲ类酶 不适用于基因工程。
• 基因工程所用的酶一般为Ⅱ类酶。 Ⅱ类酶的特点： Ⅱ型核酸内切限制酶仅有内切核酸酶的活性，而没 有甲基化酶的活性； 反应条件需Mg2+； 对DNA的水解有很强的特异性，它要求严格的识别 序列和切割点。
第二章 生物技术常用的工具酶
使核酸降解的核酸酶类（核酸内切酶和核酸 外切酶） 催化核酸合成的酶类（DNA聚合酶、RNA 聚合酶、DNA连接酶等） 核酸修饰酶类（甲基化酶、激酶、核酸转 移酶、磷酸酶等）
3′→5′外切酶 5′→3′外切酶
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸。 磷酸酶：是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。 核苷酸转移酶：催化核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶。 甲基化酶：是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。 核苷酸激酶：催化ATP的γ -磷酸转移到DNA或RNA的5′-OH末端生成ADP的反应。
例：目的片段及载体的Bgl II-Xho I双酶切 ddH2O 载体或目的片段 10×buffer H BglⅡ Xho I Total 4μL 12μL 2μL 1μL 1μL 20μL
诱发星活性的因素有如下几种：
• • • • • •
高甘油含量（＞5%，v/v）； 核酸酶用量过高（＞100U/µ ɡ DNA）； 低离子强度（＜25mmol/L）； 高pH（8.0以上）； 含有机溶剂，如DMSO，乙醇等； 非Mg2+的二价阳离子（如Mn2+，Cu2+， Co2+，Zn2+等）的存在。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶是在体外构建重组 DNA分子所必不可少的基本工具酶。
H
+
OH
OH
P
5` 3`
3` 5`
DNA ligase
5` 3`
3` 5`
DNA ligase 连接缺刻(nick)
DNA 连接酶对缺口 DNA（a）、平末端 DNA（b） 和粘性末端DNA分子（c）的连接作用如下图：

T4 DNA ligase 的作用机理
连接反应的温度： 1. 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37℃。 2. 实用温度 在37℃下粘性末端的结合很不稳定， 所以一般采用4~16 ℃。
温度
是诸多影响因素中最重要的因素!!
连接反应的体系：
标准反应 目的片段 7μL
载体
T4DNA ligase 10×ligation buffer
的DNA片段。 Xho I: CTCGAG Sal I: GTCGAC Bgl II: AGATCT Hind III: AAGCTT Sma I: CCCGGG Kpn I: GGATCC
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
② 3’端凸出（如Pst I切点）
③在识别序列内的对称轴上切割，其切割 产物具平头末端。
注：ATP=腺苷三磷酸
NAD=烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
AMP=腺苷一磷酸
NMN=烟酰胺单核苷酸
DNA连接酶的单位 一个Weiss单位是：在37℃下，20分钟内催化焦 磷酸交换1nmol 32P到ATP所需要的酶量。
DNA Ligation
三、 种类及作用机理
有二种类型的DNA连接酶：

1. E.coli DNA连接酶： 能量NAD+，只能连接粘性末端。 2. T4噬菌体DNA连接酶： 能量ATP，不但能连接粘性末端，还能连接齐 平末端。是基因工程中最常用的连接酶。
1μL
1μL 1μL
四、 使用时的注意事项

1) DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接； 2) 只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；
3) 不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的
缺口（gap）。
§3 DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用是催化DNA的体外合成反 应，它能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
四 Ⅱ类限制酶的性质 （1）性质
• 单一功能多肽；
• 反应最适pH为6~8； • 能被Mg2+激活； • 对热不稳定；通常是溶于含有50%甘油的缓冲液中贮 存于-20℃环境下；
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的 新位点一般不能再被原来的酶识别!!!
杂种位点（hybrid site），一般不能被原始酶切 割，但经常对其它酶敏感，如上图中Sau3A。
注： λ(K):感染大肠杆菌K株的λ噬菌体 λ(B):感染大肠杆菌B株的λ噬菌体
限制(restriction)
主要由限制性内切酶完成
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所 保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 一条链的甲基化，会通过 DNA的复制使另一条链也 发生甲基化。 甲基化反应供体：S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）转移给 限制酶识别序列的特定碱 基，使之甲基化。
三、 限制性内切核酸酶的命名原则
命名原则：

第一个字母（大写, 斜体）：该酶来源的微生物属名；
第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名；
若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系 的第一个字母（大多是大写）

若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和 分离的先后顺序用罗马字母表示。
五、限制性核酸内切酶的单位
酶单位的定义：在合适的温度和缓冲液中，在50μL反应体系 中，1h完全降解1μg DNA所需要的酶量。1U 酶解过程： 酶解体系；混匀，防止部分酶切；反应终止。 部分酶切（局部消化）： 指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有 部分得到切割，它的理论依据是酶切速度是不均衡的。
SmaI
5'…CCC↓GGG…3' 3'…GGG↑CCC…5'
5'…CCC 3'…GGG
+
GGG…3' CCC…5'
接头 EcoRⅠ EcoRⅠ
连接酶 重组DNA
粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互
补碱基的单链延伸末端结构。由于粘性末端能与另一个相
同的粘性末端相连接，所以在进行DNA重组时，利用限制
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌（Escherichia coli) R株分离 的第一种限制酶命名为EcoRⅠ， 其中E 代表属名 （Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系 （RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
Hind Ⅲ
属 种 株 序
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
R-M system的意义：
不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和 修饰酶组成的R-M system。修饰的本质是通过甲基化酶 将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA
上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割，而
外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制 酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来 DNA分子降解掉。所以DNA的限制和修饰作用为细菌提 供了保护，它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的
2. DNA的甲基化程度 必须使用甲基化酶失活突变的菌株。 3. 酶切消化反应温度 大多数是37℃，少数为40-65℃。 4. 酶切反应体系 使用专一缓冲液(Buffer)。 缓冲液的化学组成
限制性内切酶的星活性： 在非最适的反应条件下，有些酶的 识别特异性会降低（松动），识别序列 和切割都有一些改变，这就是所谓的星 号活性。将这种因条件改变而出现第二 活性的酶在其右上角加一个星号表示， 如EcoRI★、BamHI★。
• 对底物要求有特异的序列，通常的识别序列是4~6bp， 有些则7~8bp甚或多于8 bp。
限制酶的识别序列大多呈完全回文结构，即有对称 轴，且两条链的5’-3’ 方向的序列组成相同。 限制酶既具有识别序列的专一性，也具有切割位点 的专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有平
切和交错切，产生平末端的DNA片段或突出黏性末端
一般实验中，我们都应尽量避免 限制性内切酶出现星活性。
★★ 当两种限制酶的作用条件不同时， 若要进行双酶切，应注意先低盐，后高盐； 先低温酶，后高温酶；也可以在换酶前将 第一种酶失活后（大多数酶可用65 ℃温育 5 min失活或用乙醇沉淀DNA），再加第 二种酶，否则易产生星活性。还可以使用 通用缓冲液。
酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末 端，就可将二者连接成重组DNA分子。平末端之间的连接 效率较粘性末端之间要低，但平末端连接具有普遍的适应 性，故在重组DNA分子中极其有用。
同裂酶（Isoschizomers)
识别的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶： 识别序列和切点完全相同, 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 ② 不完全同裂酶： 识别序列相同， 但切点不同。 如Xma I 和Sma I。
§2 DNA连接酶
一、定义 能够催化2条DNA分子之间形成磷酸二酯键的酶。 可催化一段DNA的3’-羟基末端和5’-磷酸末端形成3’， 5’- 磷酸二酯键，将具粘性末端的双链DNA、平末端双
链DNA以及带缺刻的双链DNA连接起来。
二、作用低物 具有互补黏性末端的DNA片段或平末端的DNA片 段；且3’-OH，5’-P才能形成磷酸二酯键。
DNA分子引物链的3’-OH末端，合成出与模板序
列互补的产物。
延伸方向：5’
3’
基因工程中常用的DNA聚合酶
1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 共同特点 2. 主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉 下来，其它DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板 上解离下来。
一、 限制酶概念提出的背景---宿主的限制和修饰现象
限制现象：微生物的噬菌体不能交叉感染。如E.coli K
株的噬菌体只能感染E.coli K株，不能感染其他株，反之亦
然，这种现象称为“限制现象”。 修饰现象：被某些细菌限制的噬菌体群中，也有极少 数能幸存下来，仍可以在原来受限制的菌株中正常繁殖， 这种现象称为“修饰现象”。
完全消化 内切酶在DNA上
的所有识别位点都被切开。
局部消化 只有有限数
量的酶切位点被切开。
通过缩短保温时间、降低反 应温度或减少酶的用量可达 到局部消化的目的。
六、影响限制性内切酶活性的因素
1. DNA 纯度： DNA 样品中的蛋白质、酚、氯 仿、酒精、EDTA、SDS及高浓度的盐离子 等，都会抑制限制酶的活性。 提高限制酶效率一般方法： （a）增加限制酶的用量。 （b）延长酶催化反应的保温时间。 （ c）扩大酶催化反应体积（ >20μl ），以 相应地稀释潜在的抑制因素。
பைடு நூலகம்
例：目的片段及载体的BamH I-Sal I双酶切
目的片段及载体的BamH I 酶切体系 ddH2O 4μ L 载体 or纯化的DNA片段 12μ L 10×buffer K 2μ L BamH I 2μ L Total 20μ L
30℃保存3h，60℃灭活15min，再加入10×buffer H 2μL， Sal I 1μL，直至终体积23μL。点动混匀，37℃保存3h，60℃ 灭活15 min 。