红米花青素检测报告-2

“红米提取物”花青素类化合物测试报告2012年8月2号接到云南瑞宝生物科技有限公司邮寄来的红米提取物S-HMT120731、紫甘薯提取物S-ZGT120730A、甘蓝提取物S-GT120730A、萝卜提取物S-LT120730A，其中除红米样品外的其他样品的测试工作仍未完成。

红米样品中已完成花青素的检测任务，具体工作内容及结果如下：
定性：采用制备色谱对样品中花青素进行分离纯化，收集纯化后的样品进行紫外光谱扫描（UV）、飞行时间多级质谱（MS n）检测，并将结果进行了数据解析，推测化合物结构。

定量：采用HPLC技术，外标法定量“红米样品”中三种花青素。

1.研究方法
1.1 定性研究
1.1.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。

ESI-IT-TOF 质谱仪（Shimadzu公司，日本）。

岛津UV2550 紫外分光光度计。

甲醇，乙酸等。

1.1.2 样品溶液制备
称取红米样品400mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度为40mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。

1.1.3实验条件
1.1.3.1制备色谱条件
制备色谱系统：色谱柱，C18，250mm×8 mm，粒径：20-40μm；流动相：V (甲醇) /V (水)/V (乙酸) = 40：60：0.5；检测波长：520 nm；进样体积：2.5 mL；进样量：100 mg；柱温：室温。

样品溶液分5次进样，每次2.5mL，收集保留时间为8.2，11.5和12.8min的三个流份。

合并5次收集的流份，分别冷冻干燥，得三种花青素浓缩液，该浓缩液用于以下的质谱检测及紫外光谱扫描。

1.1.3.2 质谱条件
电喷雾电离：正离子模式喷雾电压4.5kV。

加热模块（BH）温度200℃；曲形脱溶剂管（CDL）温度200℃。

碰撞诱导解离（CID）参数: （1）碰撞能量：MS1～MS3，50%。

（2）碰撞气比例：MS1～MS3, 50%。

（3）碰撞时间：MS1～MS3，30ms。

雾化气采用氮气（纯度≥99.5%），流速1.5L/min，检测器电压1.70kV。

高纯（纯度≥99.99%）氩气作为CID碰撞气及冷却气。

使用2.5mmol/L三氟醋酸钠溶液对正、负离子模式下m/z 100--1000范围的质量数进行校正。

使用自动采集模式，每一级质谱自动选择基峰离子作为下一级质谱的母离子进行碎裂。

据分析由LCMS solution 3.41工作站完成。

结合分子式预测软件（日本岛津公司）对多级质谱碎片作综合分析，得到化合物的分子式及碎片信息。

1.1.3.3 紫外扫描测试
将三种浓缩液分别配成约1mg/mL的水溶液在UV2550紫外/可见光度计上作1000-190nm全程扫描。

花青素特征吸收峰为270-280nm与500-540 nm。

1.2 定量研究
1.2.1 仪器及试剂
WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。

标准品飞燕草素葡萄糖苷，甲醇，乙腈，甲酸等。

1.2.2 溶液制备
样品溶液制备：称取红米样品60mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度
为6mg/mL 的储备液，置于4℃冰箱中备用。

样品溶液0.22μm 过滤膜过滤后用于液相色谱分析。

标准溶液制备：称取标准品飞燕草素葡萄糖苷1mg ，用1mL 甲醇溶解，配成质量浓度为1mg/mL 的储备液，将上述储备液稀释至0.1mg/mL 备用。

样品溶液0.22μm 过滤膜过滤后用于液相色谱分析。

1.2.3实验方法
1.2.3.1分析色谱条件
Diamonsil (钻石) C 18色谱柱( 250 mm×4.6mm , 5μm)，流动相：A 相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，B 相为0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液。

梯度洗脱程序: 0~2min ，90%A ；2~9min ，90%A→80%A ；9~10min ，80%A→70%A ；10~12min ，70%A→60%A ；12~13min ，60%A→55%A ；13~14min ，55%A→50%A ；14~14.5min ，50%A→80%A ；14.5~16.5min ，80%A ;16.5~30min ，80%A→90%A 。

流速: 1.0 mL/min; 柱温: 35℃；检测波长范围: 520nm ；进样量：20μL 。

外标法定量
化合物色谱峰面积单点外标法计算出溶液浓度，从而计算出红米样品三种花青素的含量。

2. 图谱
图1.化合物1（制备色谱8.2min ）紫外扫描图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
0.51.0Inten.(x 10,000,000)449.1071(1)
287.0527(1)227.9813595.1641(1)
378.3212
725.8532897.2408
图2. 化合物1（制备色谱8.2min ）一级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
1.0Inten.(x 10,000,000)
287.0517(1)
451.1074(1)213.0560118.1987
图3. 化合物1（制备色谱8.2min ）二级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
2.5
Inten.(x
1,000,000)287.0526(1)
213.0525342.4709
图4. 化合物1（制备色谱8.2min ）三级质谱图
21
图5.化合物2（制备色谱11.5min ）紫外扫描图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
5.0
Inten.(x 1,000,000)463.1219(1)
301.0686(1)
518.8473(1)378.3223
765.1693(1)
图6. 化合物2（制备色谱11.5min ）一级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
0.5
1.0Inten.(x 10,000,000)
301.0676(1)
258.0480
465.1268(1)85.7447
图7. 化合物2（制备色谱11.5min ）二级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
1.02.0Inten.(x 1,000,000)286.0456
258.0518
201.052855.7044
图8. 化合物2（制备色谱11.5min ）三级质谱图
20
图9.化合物3（制备色谱12.5min ）紫外扫描图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
2.5Inten.(x 1,000,000)
287.0530(1)
227.9812518.8480(1)378.3211
686.9641
图10. 化合物3（制备色谱12.5min ）一级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
2.5
Inten.(x 1,000,000)288.0576(1)
213.0549
图11. 化合物3（制备色谱12.5min ）二级质谱图
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
m/z
0.0
5.0
Inten.(x 10,000)129.0713
图12. 化合物3（制备色谱12.5min ）三级质谱图
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
min
-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0mAU(x1,000)
Extract-520nm,4nm (1.00)
1
2
3
图11.红米样品溶液液相色谱图
3.花青素组分解析结果
5
分子量：493 矢车菊素半乳糖苷484.84 C21H21ClO11CAS NUMBER: 27661-36-5
6
4.结论
红米提取物S-HMT120731中含有三种花青素类化合物，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷及矢车菊素；三种花青素占红米提取物的质量百分含量：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷58.48%，锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷3.25%，矢车菊素0.91%。

5.研究费用清单。