目的基因的获取
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2、补丁延长法：根据目的基因两条互补链全
序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 以及20-30碱基长的单链DNA中片段
预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3、大片段酶促法：根据目的基因的全序列， 分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作 为另一个片段延长的引物。
3’
template
5’
5’
template
3’
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三、筛选基因文库(gene library)
➢ 基因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）。每个种群都具有其独特的基因库。
➢ 基因文库（gene library or gene bank）
通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
（三）基因组文库的构建程序
基因组文库： 包含某种生物基因组 全部遗传信息的一系列DNA片段，通过 克隆载体贮存在一种受体菌的群体中， 这个群体称为这种生物的基因组文库。
文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组 合起来可以覆盖该生物的整个基因组。
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（四）基因组文库的构建程序
氧化:碘
3’－5’磷酸二 酯键
氧化反应
引物、接头 、探针等
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）基因组装战略：
1、小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合 成12-15碱基长的单链DNA小片段
粘性末端
预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之 间的互补区域能形成有断点的完整双链。
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1、基因组DNA的制备和切割
（保证DNA片段之间存在部分重叠；DNA片段大小均一）
超声波处理 限制性内切酶部分酶切
2、载体和受体的选择 基因组文库：λ-DNA或考斯质粒， 大型基因组使用YAC或BAC cDNA文库构建载体：质粒
受体：大肠杆菌或酵母菌
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3、DNA片段和载体的相连 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
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（二）理想基因文库条件
1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为 99%
2、重组克隆的总数不宜过大 3、载体的装载量最好大于基因的长度 4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠
区域 5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下 6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
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（三）DNA化学合成的用途
合成天然基因:胰岛素基因、干扰素等； 有些基因比较短，化学合成费用较低。 修饰改造基因，设计新型基因。 “人造儿”
2010，5.20， 美国64岁科学家 10年耗资4000万美元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因 后导入到支原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进 行复制－人造生命诞生。 制备探针、引物、接头 定点突变合成：合成带有定点突变的基因片断。
➢影响因素：基因组大小、目的基因在基因组中 的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小。
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基因文库的完备性: 在构建的基因文库中任一基因存在的概率 。 完备性越高，文库容量越大。
例：人的单倍体DNA总长为2.9×109bp，基因文 库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完 备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当 完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆。
➢操作过程：液相合成 固相合成
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➢固相亚磷酸三酯法原理：
将所要合成的寡核苷酸链的3’末端先以3’OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠、二氧化 硅等连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸 单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能 团都是经过保护的，其中5’-OH用二甲氧基三 苯甲基（DMT）保护，3’-端的二丙基亚磷酸 酰上的磷酸的OH，用甲基或氰乙基保护。
4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基 因组文库的初库（primary bank）
5、初库扩增形成终库 把培养皿上的细菌全部洗下加以保存。
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（五）cDNA文库的构建
某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与 合适的克隆载体相连，通过转化贮存在一种 受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因 组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物 cDNA文库。
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➢目的基因的获取：
化学合成法
PCR技术
筛选基因文库
转座子标签法
mRNA差别显示技术
生物信息技术分离和鉴定
酵母双杂交系统分离
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一、化学合成法
（一）化学合成法的单元操作
➢从反应机理上分为：磷酸二酯法、磷酸
三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法
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二、PCR技术获得目的基因
➢ 反转录PCR：RT-PCR，以mRNA逆转录合成的
cDNA第一条链为模板的PCR。
➢ 引物：基因边码区引物，oligo（dT）12-18， ➢ 氨基酸序列设计特异引物：简并引物
➢ 反向PCR：根据已知DNA区的序列设计引物，以包含
已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知来自百度文库DNA区序列的PCR技术。
➢根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库和cDNA文库
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（一）基因文库的容量和完备性
在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基 因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N=ln（1-P）/ln（1-f） P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
1核苷酸的保护
➢亚磷酸三酯法合成过程 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
DMT:二甲氧基三苯甲基
酸（三氯乙酸）洗柱子
1核苷酸连柱子
2核苷酸活化
四氮唑活化剂
氰乙基
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二异丙基亚磷酸酰 亚磷酸三酯
缩合反应
二异丙胺 激活：氨基亚磷酸化合物 磷氧原子保护基团：氰乙基
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序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 以及20-30碱基长的单链DNA中片段
预先设计合成的短片段与长片段的某段序列互补。
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3、大片段酶促法：根据目的基因的全序列， 分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
预先设计的片段之间有局部互补区，可以相互作 为另一个片段延长的引物。
3’
template
5’
5’
template
3’
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三、筛选基因文库(gene library)
➢ 基因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）。每个种群都具有其独特的基因库。
➢ 基因文库（gene library or gene bank）
通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
（三）基因组文库的构建程序
基因组文库： 包含某种生物基因组 全部遗传信息的一系列DNA片段，通过 克隆载体贮存在一种受体菌的群体中， 这个群体称为这种生物的基因组文库。
文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组 合起来可以覆盖该生物的整个基因组。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（四）基因组文库的构建程序
氧化:碘
3’－5’磷酸二 酯键
氧化反应
引物、接头 、探针等
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（二）基因组装战略：
1、小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合 成12-15碱基长的单链DNA小片段
粘性末端
预先设计合成的片段之间都有互补区域，不同片段之 间的互补区域能形成有断点的完整双链。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
1、基因组DNA的制备和切割
（保证DNA片段之间存在部分重叠；DNA片段大小均一）
超声波处理 限制性内切酶部分酶切
2、载体和受体的选择 基因组文库：λ-DNA或考斯质粒， 大型基因组使用YAC或BAC cDNA文库构建载体：质粒
受体：大肠杆菌或酵母菌
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3、DNA片段和载体的相连 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）理想基因文库条件
1、完备性高，筛选任一基因的概率均应为 99%
2、重组克隆的总数不宜过大 3、载体的装载量最好大于基因的长度 4、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠
区域 5、克隆片段易于从载体分子上完整卸下 6、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（三）DNA化学合成的用途
合成天然基因:胰岛素基因、干扰素等； 有些基因比较短，化学合成费用较低。 修饰改造基因，设计新型基因。 “人造儿”
2010，5.20， 美国64岁科学家 10年耗资4000万美元 用电脑进行基因设计改造后，用化学方法合成基因 后导入到支原体细菌，DNA象正常细菌的基因一样进 行复制－人造生命诞生。 制备探针、引物、接头 定点突变合成：合成带有定点突变的基因片断。
➢影响因素：基因组大小、目的基因在基因组中 的拷贝数、克隆载体的容量及目的基因的大小。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因文库的完备性: 在构建的基因文库中任一基因存在的概率 。 完备性越高，文库容量越大。
例：人的单倍体DNA总长为2.9×109bp，基因文 库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完 备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当 完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆。
➢操作过程：液相合成 固相合成
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
➢固相亚磷酸三酯法原理：
将所要合成的寡核苷酸链的3’末端先以3’OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠、二氧化 硅等连接，然后依次从3’-5’的方向将核苷酸 单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能 团都是经过保护的，其中5’-OH用二甲氧基三 苯甲基（DMT）保护，3’-端的二丙基亚磷酸 酰上的磷酸的OH，用甲基或氰乙基保护。
4、重组体转化宿主细胞，构建形成了基 因组文库的初库（primary bank）
5、初库扩增形成终库 把培养皿上的细菌全部洗下加以保存。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（五）cDNA文库的构建
某生物mRNA反转录产生cDNA片段分别与 合适的克隆载体相连，通过转化贮存在一种 受体菌的群体之中，把这种包含某生物基因 组全部基因cDNA的受体菌群体称为该生物 cDNA文库。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
➢目的基因的获取：
化学合成法
PCR技术
筛选基因文库
转座子标签法
mRNA差别显示技术
生物信息技术分离和鉴定
酵母双杂交系统分离
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、化学合成法
（一）化学合成法的单元操作
➢从反应机理上分为：磷酸二酯法、磷酸
三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、PCR技术获得目的基因
➢ 反转录PCR：RT-PCR，以mRNA逆转录合成的
cDNA第一条链为模板的PCR。
➢ 引物：基因边码区引物，oligo（dT）12-18， ➢ 氨基酸序列设计特异引物：简并引物
➢ 反向PCR：根据已知DNA区的序列设计引物，以包含
已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知来自百度文库DNA区序列的PCR技术。
➢根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库和cDNA文库
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（一）基因文库的容量和完备性
在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基 因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N=ln（1-P）/ln（1-f） P=任一基因被克隆（存在于基因文库中）的概率 f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
1核苷酸的保护
➢亚磷酸三酯法合成过程 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
DMT:二甲氧基三苯甲基
酸（三氯乙酸）洗柱子
1核苷酸连柱子
2核苷酸活化
四氮唑活化剂
氰乙基
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二异丙基亚磷酸酰 亚磷酸三酯
缩合反应
二异丙胺 激活：氨基亚磷酸化合物 磷氧原子保护基团：氰乙基
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