蛋白质复性(苏志国)

蛋白质的折叠复性
苏志国
中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室


中国科学院过程工程研究所 Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences 原名：中国科学院化工冶金研究所，建立于1958年， 2001年更名


3个重点实验室（2个国家重点，1个中科院重点），1个国家工程中心 职工280人，学生360人；主要方向：生化工程，清洁化工，多相反应


生化工程国家重点实验室(1992) 国家生化工程技术研究中心（1996）
Initial investment 4 millions USD 12 professors，16 associate professors，120 students


生化工程
（生物化学工程，Biochemical Engineering）
生物技术
化学工程
生物技术产业化：突破瓶颈 化工可持续发展：建立新过程


研究领域
1980s 1990s 2000s-
医药生物技术
农业生物技术
生化工程 生化反应过程
工业生物技术
生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品 其它产品
原料、辅料 ＋ 生物催化剂
生化分离过程 生化装备与介质 流程设计与优化
过程的基本规律和集成优化


美国生物技术产品销售额趋势
400 350 334 300 250 200 150 100 50 0 10 59 101 182 147 215 362
亿 美 元
平均增长率:20%，融资增长率：20% 就业增长率：12.5%，股市平均涨幅:8.76%
19 80 19 91 19 96 19 98 20 01 20 03 20 06 20 08


美国各类生物技术产品销售额
(2000年158.5亿美元)
16%
人治疗药
5% 3% 2%
诊断试剂 农 业
特殊化合物
74%
非医学诊断剂
资料来源：Consulting Resources Corp


100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
核酸药物 细胞因子 基因治疗 抗体 溶栓药物 疫苗 激素
已上市 临床中


目前生物技术的最大成功 – 蛋白质药物
用微生物、动物细胞生产人体药用蛋白质或疫苗
载体 DNA
人体 某种蛋白质 基因 转化
重组体
发 酵 罐 或 细 胞 培 养 罐
气体
克隆微生物、动物细胞


某单克隆抗体的生产线—分离纯化流程复杂
生物分离工段


分离纯化 占总成本 60-90%
分离纯化


举例：剪切失活 － 泵送造成蛋白质絮凝体
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
0 20 10 30
Filtrate volume (ml)
1 mg/ml 500ml/min
No pumping 5 min pumping 10 min pumping
Membrane filtration
0.2 µ
Filtration time (min)


干 扰 素（Interferon）
IFN-α(IFN-β,γ, ω) 白细胞产生 165－166 氨基酸 4个半胱氨酸，两对二硫键 Cys1-Cys99；Cys29-Cys139 市场上销售前10名的生物药


Size and shape of soluble proteins
D.S. Goodsell and A.J. Olson, TIBS 18:3 (1993) 65-68


蛋白质药物生产的基本流程
基因工程细胞
生 物 反 应 器 离心机
膜分离器
（分离细胞和培养基） 胞内产品 细胞破碎机
碎片分离
蛋白质复性
胞外产品
成 品
膜分离器 (I) 层析法 (I) 层析法 (II) 膜分离器 (II) 冷冻干燥或 分装


蛋白质回收率变化范围
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
低值 高值
回收率
复性
盐析
膜分离
层析


scFv57P包涵体
蛋白质的重折叠（复性）
（大肠杆菌表达产物）
显微镜下含scFv57P包涵体的 E. Coli 示意图
包涵体
伸展肽链
活性蛋白质
加变性剂 溶解
远离变性剂后 自动折叠


最常用的折叠方法 – 溶液稀释
变性蛋白质
稀释
复性溶液 例：磷酸盐 缓冲液
稀释率1:10-200


不同稀释倍数和时间对复性的影响
14000
Specific activity (U/mg)
12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 100 200 300 400
200 100 10
Time (min)
原料：6mg/mL溶菌酶（8mol/L脲） 复性溶液0.1mol/L Tris-HCl at pH8.8, 1mol/L Urea, 3mmol/L GSH and 0.3mmol/L GSSG.


不同终点浓度对蛋白质复性的影响
200 180
Specific activity (U/mg)
160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100
40 ug/mL 60 ug/mL 80 ug/mL 100 ug/mL
Refolding time (h)
原料：4 mg/L SOD,50mmol/L PBS缓冲液，10mol/L脲 复性溶液：50 mmol/L PBS at pH7.4, 2 mol/L Urea and 0.1 mol/L NaCl


蛋白质折叠的途径分析
未折叠肽链 U U↔I1↔ I2↔· · ·↔C
↕
M 中间体 I
A
其它可能： M+M↔A M+I↔A M+C↔A I +C↔A
错误M
正确C
絮凝A


复性溶液的组成：
除了缓冲盐还应该有什么？
变性蛋白质
稀释
复性溶液 （组分X+Y+Z+。

）
稀释率1:10-200


常用的复性添加剂（人工伴侣）
蛋白
胰凝乳蛋白质酶原 血小板衍化生长因子 scFv 白介素 复合干扰素 溶菌酶 牛碳酸酐酶 α淀粉酶
添加剂
盐酸胍 盐酸胍 脲 脲 精氨酸 精氨酸 PEG 环糊精
添加浓度
1.2M 1M 2M 2M 0.5M 0.75M 10mg/ml 10mM
效果
活性最高 抑制折叠 收率最高 聚集最少 不抑制寡聚 活性最高 抑制沉淀 活性提高


脲及盐酸胍也可以是“人工伴侣”
提高折叠中间体的溶解性 增加肽链的柔韧性 促进折叠，抑制聚集 浓度影响很大
ClNH2 H2 N O
盐酸胍 脲
NH3+ HN NH2
urea
guanidinium chloride
脲及盐酸胍与溶菌酶的结合


L-精氨酸作为“人工伴侣”
提高折叠中间体的溶解性 减弱蛋白－蛋白之间的作用 增强折叠中间体的稳定性 抑制聚集 应用最为广泛
NH2 H 2N H N OH
NH
O
arginin


精氨酸作用－ 抑制蛋白质絮凝沉淀物的生成
随精氨酸浓度增加，其抑制聚集沉淀的作用增强。

精氨酸作用机理探讨－
对结构的影响
精氨酸更有利于形成类天然结构


精氨酸作用机理的深入探讨
－ 浓度非常重要
SEC（TSK2000）
随精氨酸浓度增大，单体含量下降，同时寡聚体含量上升


不同人工伴侣可以组合：脲和精氨酸（1）
monomer yield relative activity
80 7 8.0×10
60
7 6.0×10
40
7 4.0×10
20
7 2.0×10
0
0M1
2 0.5M
3 1M
4 1.5M
G-CSF复性的蛋白收率和比活 复性溶液：2M脲+不同浓度的精氨酸
Relative activity (IU/mg)
Monomer yield (%)


不同人工伴侣可以组合：精氨酸和脲（2）
monomer yield relative activity
80 7 8.0×10
60
7 6.0×10
40
7 4.0×10
20
7 2.0×10
0
0M 1
1M 2
2M 3
4 3M
4M5
G-CSF复性的蛋白收率和比活 复性溶液：0.5M精氨酸+不同浓度的脲
Relative activity (IU/mg)
Monomer yield (%)


稀释法复性的缺点与改进的方案
稀释法的缺点： 浓度低（ng/ml) 体积大（增大20－40倍） 复性率低（常常<20％) 改进的方案： 膜透析复性 反胶束复性 固相辅助复性


层析纯化: 蛋白药物必须的单元操作


固相辅助复性 –层析（色谱）法
蛋白质层析的类型
吸附层析
凝 胶 过 滤
亲和层析 金属螯合
离子交换
疏水层析


凝胶过滤层析复性
固相介质作为折叠伴侣 能分离错误折叠与正确折叠结构
介质的微观 层 析 柱


最初的尝试: 借鉴蛋白质分离
变性蛋白溶液 采用复性缓冲液直接洗脱
unsuccessful
蛋白不能从柱上洗脱 常常造成层析柱堵塞


可能原因: 柱上溶液环境突然变化
C0
变性剂浓度
Cf 错误折叠 天然结构 聚集体 层析柱长度


技术创新: 使用梯度复性
预平衡 (设值梯度) 上样 改变缓冲液 梯度洗脱
C0
Urea concen.
C1 C2 C3
Column length
活性蛋白


Refolding of scFv57P with different methods
Specific activity Activity recovery 60
Recovery (%)
40
20
0
a
b c d Refolding methods
a: Dilution; b: SEC without gradient; c: SEC with denaturant gradient;d: SEC with dual gradients of denaturant and pH. The specific activity


离子交换及疏水层析复性过程
Adsorption Folding elution
变性剂浓度


离子交换三梯度复性溶菌酶
1600 6 1400 5 10 0.3
A280
NaCl
Urea
pH 0.4
Urea (mol/L)
A280 (mAU)
1200 1000 800 600 400
pH
4 3 2 1
8 7 6
0.2 0.1 0.0
0
2
4
6
Dimensionless volume (L/(L medium))
NaCl (mol/L)
9


不同操作方式对离子交换层析复性溶菌酶的影响
4.5 4.0 3.5
Activity (*10 u/mg)
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
t t t
4
Dilution
IEC without IEC with Urea IEC with gradient gradient pH gradient
t
IEC with Urea and pH gradients
IEC: ion exchange chromtography


利用层析设备建立多参数梯度复性
混合
变性蛋白
变性剂浓度
pH, osmolyte, etc.


二硫键在折叠中的形成
I n te r m e d ia te
D e n a tu r e d
W r o n g f o ld e d


pH 梯度辅助二硫键的正确配对
恒定 pH生成 错配和分子 间二硫键
pH梯度变化 促进正确二 硫键的形成


梯度长度对HIC复性溶菌酶的影响
洗脱 洗脱方式 盐梯度 梯度长度 蛋白收率 6％ 活性回收 3.1％
脲脉冲
20.7％
17％
脲梯度 (1)
13.7％
12.7％
脲梯度 (2)
79％
52％
Note：
Salt；
Urea；
Buffer


聚乙二醇及盐酸胍双梯度复性复合干扰素
Specific Activity (IU/ml)
500
60
400
60
1000 800 A280 (mAU) 600 400 200 0 0
GmdCl (mol L )
P2
4
PEG % (w:v)
A280 (mAU) -1 GmdCl (mol L ) PEG % (w:v)
P1
6
-1
10 8 6 4 2
300 40 200 20
40
100
20
P0
2
0
1
2
3
4
5
0
0
1。

稀释复性, 2。

10 % PEG 200稀释复性, 3。

无梯度HIC 复性, 4。

盐酸胍单梯度HIC 复性, 5。

PEG及盐酸胍双梯度HIC
0 10 20 30 40 50 60
0
Elution volume (ml)
Soluble protein yield (%)
80
%(specific activity) %(soluble protein yield) %(soluble protein concentration)
600
Soluble protein concentration (ug ml )
-1
100
100
80


甘油对疏水层析复性溶菌酶效果的影响
复性方式 稀释法 HIC HIC HIC HIC 甘油添加方式 添加剂 否 吸附后洗脱剂 柱后添加 等度洗脱剂 活性收率 可溶性蛋白回收率 (%) (%) 32.9 50.9 86.3 58.8 59.7 36 80 85 80 81 比活回收率 (%) 91 59 100 68 73


复性种类
层析方法
凝胶过滤
洗脱机制
蛋白质直接进柱洗脱 蛋白质直接进柱洗脱 脲浓度洗脱 脲和pH值梯度洗脱 双梯度洗脱 三种缓冲液系统 蛋白质直接进柱洗脱
蛋白质
rETS-1 isoform PDGF scFv Human lysozyme SOD His-TNF human interferon -α human interleuki n-2 Lysozyme Lysozyme Lysozyme
回收率
75% 75% 14.5% 17.3% 25% 50% 40% 90% 稀释复性的2倍
缓冲液置换 梯度凝胶过滤
离子交换 金属亲和 可逆吸附 疏水色谱
反相色谱 分子伴侣 固定折叠伴侣 脂质体 PEG
蛋白质直接进柱洗脱 蛋白质直接进柱洗脱 蛋白质直接进柱洗脱 蛋白质直接进柱洗脱
稀释复性的9倍 85% 90% 90%


层析复性蛋白质的拓展
固定化PEG介质复性蛋白质 固定化环糊精介质复性蛋白质 固定化表面活性剂介质复性蛋白质 固定化精氨酸介质复性蛋白质 。

。