IgG抗体的提取及鉴定总结

封闭：每孔加入封闭液0.1ml， 4℃孵育1h 。
洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次3min，甩净，拍干。
加酶标抗体：每孔加入稀释至工作浓度的酶 标抗体100μl，37℃孵育1h。
洗涤：手工洗板，弃液拍干，重复5次
加底物显色：每孔加底物液50μl，置37℃孵育15min。
终止反应：每孔加入50μl的2M H2SO4，混匀
洗板
加底物
加底物 加终止液 加终止液
原理示意图
人血清IgG抗体的检测
——直接ELISA法
测定原理：
将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人 IgG抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被IgG
结合，最后形成IgG-酶标羊抗人IgG抗体复合物，
加入底物产生显色反应。
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【 步 骤 】
包被：用包被缓冲液将纯化抗体稀释至0、2、4、6、8、10mg/L。 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释液，4℃过夜。
《医学免疫学与免疫学技术实验》
贵阳医学院免疫学教研室
人血清IgG的提取及鉴定
2014-04-22
人血清IgG的提取及鉴定
离子交换层析法提取人IgG
血清IgG鉴定
人血清IgG的提取及鉴定
离子交换层析法提取人IgG流程：
DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清） 装柱、平衡 上样和洗脱 DEAE-纤维素再生
所含抗原成分及其性质。
实验步骤
人血清
电泳
+
提纯物
-
双扩散
兔抗人血清
酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG
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酶联免疫吸附试验原理
利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上 ，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗
体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶
底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根
据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗

人血清IgG鉴定 ：
洗脱液抗原性鉴定—琼脂双扩散 纯度鉴定—免疫电泳 回收率的测定—分光光度法 IgG回收量的测定-直接ELISA

离子交换层析的基本原理
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是以离子交换剂为固定 相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或 离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离 纯化的层析方式。
离子交换层析的基本过程
带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多， 亲和力大的后被洗脱下来。
离子交换剂
在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即 离子交换剂。 纤维素－O－CH2－COO-－Na＋
基质 电荷基团 反离子
阴离子交换剂
二乙氨乙基纤维素，弱碱性
DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。
原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法 、间接法、双抗体法和抗原竞争法。
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直接ELISA
包被(未知抗原）
间接ELISA
包被(已知抗原） 加入待检标本 （未知抗体）
加入酶标第二抗体 ﹙抗抗体﹚ 洗板
双抗体夹心法
包被(已知抗体）
加入待检标本 （未知抗原） 加入酶标抗体 洗板 加底物 加终止液
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加入酶标抗体
分光光度法
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨 酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质， 其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收 峰的光密度值与其 浓度成正比关系，故可作为蛋 白质定量测定的依据。
实验步骤
9、合并含IgG的洗脱液，通过蔗糖包埋法进行浓缩。 10、通过分光光度法对浓缩后的IgG进行回收率的测定。 提取 IgG（mg） 12（mg/ml）×上样血清体积
6、DEAE-纤维素再生
2M NaCl 洗脱其他血பைடு நூலகம்蛋白 拆柱、 浸泡 PH7.4 0.01M PB液
洗脱液抗原性鉴定
双向琼脂扩散实验原理：
可溶性Ag和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。 相应的Ag和Ab相遇后，在比例合适时可形成 白色沉淀线。
实验步骤
7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）
抗体 抗原
IgG回收率的测定
回收率=
=
OD280 ×1.43 ×回收体积 12（mg/ml）×上样血清体积
回收IgG纯度鉴定
免疫电泳原理：（immune electrophoresis）
先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，将 样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干 区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽 中含相应抗体的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩 散。各区带蛋白在相应位置与抗体形成弧形沉淀 线。根据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中
人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理
人IgG特性:
血清含量：9.5-12.5 mg/ml ；血清中的IgG属 于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白 （pI:4-5 ）。
DEAE-纤维素提取IgG原理：
在pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白被DEAE纤维素吸附， IgG不被吸附而最早从柱中流出， 而得以纯化。
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3、样本（人血清）准备
抽静脉血分离血清透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜）
4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）
实验步骤
5、上样、洗脱、收集洗脱液
上样 流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清） 洗脱 流速30-40ml/cm2/h 收集 5ml/管 （20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测）
实验步骤
1、DEAE-纤维素预处理：
强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） 强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0） PH7.4 0.01M PB液浸泡抽滤、浸泡
2、装柱、平衡固定层析柱
装 柱：柱高度、无分层、无气泡