米氏常数的测定(精)
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1
v
1 Km
1
[S]
6 反应速度v的测定
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 时间 15 20
产物量
系列1
7 胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸） 的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基。 8 氨基的测定 甲醛滴定法。 COOCH2 NH2
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求：
1. 了解底物浓度对酶促反应的影响。 2. 掌握测定米氏常数Km的原理和方法
原理： 1. Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的 底物浓度。 2 Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与 不同底物反应Km值也不同。 Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明 亲和力小；Km值小，表明亲和力大。 测定Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值 在0.01-100mmol/L。
思考题： 1. 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2. 试述在何种条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种 手段。 3 米氏方程中的Km值的实际应用是什么？ 4 本实验中的注意事项是什么？
4 米氏方程： V[S] v = Km + [S ] v : 反应初速度 （微摩尔浓度变化/min) V : 最大反应速度 （微摩尔浓度变化/min) [S]：底物浓度 （mol/L) Km: 米氏常数 （mol/L)
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
5 双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
HCHO
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
பைடு நூலகம்
COOCH2 NH(CH2OH)2
操作方法 1. 50ml 三角瓶4个，每个加入甲醛5ml及酚酞1滴，用0.1M标准 NaOH 滴定至微红色。该组4个瓶溶液颜色应当一致，编号。 2. 150ml反应三角瓶中加入37预热10min的硌蛋白溶液，胰蛋白 酶液，立即混匀,同时计时。 取出0min，2min，4min，6min时的反应液各10ml加入1中编号 的含有甲醛的三角瓶中，加入酚酞10滴。用0.1M标准NaOH 滴定 至微弱而持续的微红色。接近终点时，按耗去的NaOH毫升数，每 1ml加酚酞1滴，再继续滴定至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH毫 升数。 3. 初速度 v 的测定。 以滴定度（耗去的0.1M标准NaOH毫升数）对时间作图，得一 直线，其斜率即为初速度 v 。 4. 以40g/L，30g/L，20g/L，10g/L的硌蛋白溶液为底物，进行2-3 操作，分别测出 v40,v30,v20,v10. 5. 用双倒数法，以1/v对1/[S]作图，求出V和Km.
v
1 Km
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[S]
6 反应速度v的测定
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 时间 15 20
产物量
系列1
7 胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸） 的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基。 8 氨基的测定 甲醛滴定法。 COOCH2 NH2
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求：
1. 了解底物浓度对酶促反应的影响。 2. 掌握测定米氏常数Km的原理和方法
原理： 1. Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的 底物浓度。 2 Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与 不同底物反应Km值也不同。 Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km值大，表明 亲和力小；Km值小，表明亲和力大。 测定Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值 在0.01-100mmol/L。
思考题： 1. 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2. 试述在何种条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种 手段。 3 米氏方程中的Km值的实际应用是什么？ 4 本实验中的注意事项是什么？
4 米氏方程： V[S] v = Km + [S ] v : 反应初速度 （微摩尔浓度变化/min) V : 最大反应速度 （微摩尔浓度变化/min) [S]：底物浓度 （mol/L) Km: 米氏常数 （mol/L)
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
5 双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
HCHO
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
பைடு நூலகம்
COOCH2 NH(CH2OH)2
操作方法 1. 50ml 三角瓶4个，每个加入甲醛5ml及酚酞1滴，用0.1M标准 NaOH 滴定至微红色。该组4个瓶溶液颜色应当一致，编号。 2. 150ml反应三角瓶中加入37预热10min的硌蛋白溶液，胰蛋白 酶液，立即混匀,同时计时。 取出0min，2min，4min，6min时的反应液各10ml加入1中编号 的含有甲醛的三角瓶中，加入酚酞10滴。用0.1M标准NaOH 滴定 至微弱而持续的微红色。接近终点时，按耗去的NaOH毫升数，每 1ml加酚酞1滴，再继续滴定至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH毫 升数。 3. 初速度 v 的测定。 以滴定度（耗去的0.1M标准NaOH毫升数）对时间作图，得一 直线，其斜率即为初速度 v 。 4. 以40g/L，30g/L，20g/L，10g/L的硌蛋白溶液为底物，进行2-3 操作，分别测出 v40,v30,v20,v10. 5. 用双倒数法，以1/v对1/[S]作图，求出V和Km.