第九章 酶的固定化技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
36
三、固定化酶的评价
1、固定化酶的活力：
固定化酶的催化活力表征催化某一化学反应的 能力。可用一定条件下催化某一反应的初速度来 表示。
固定化酶颗粒：每毫克每分钟转化底物或生成产物的 量，表示为 μmol/(min· mg)；
固定化的酶膜、酶管、酶板，以单位面积的反应初速 率来表示，表示为 μmol/(min· cm2) 。
离子结合
共价结合
交联
聚合物包埋
疏水相互作用
脂质体包埋
微胶囊
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
10
二、酶的固定化方法
酶固定化的方法：
载体结合法 交联法 包埋法
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
11
（一）载体结合法
1、通过氢键、疏水性相互作用、静电作用等物理 作用，将酶吸附于不溶性载体的固定化方法。 优点：酶活性中心不易破坏，酶高级结构变化小
疏水性：载体与底物或产物的疏水作用
思考：载体疏水性和底物极性怎样影响底物的分配？
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
29
一、引起固定化酶变化的因素
5、扩散限制效应：
底物、产物或其他效应物在固定化酶微环境与宏观环境 之间迁移或运转速度受到限制的一种效应，使上述物质在 这些区域的分布不等。
底物和产物的传质过程
20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展
1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固 定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，实现了酶应 用史上的一大变革。 在 1971 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用 “ 固 定 化 酶 ” （ immobilized enzyme ） 的 名 称 。
③ 与固定化死细胞相比稳定性提高
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
22
三、细胞的固定化
（三）固定化活细胞：
将活细胞固定在载体上，并使其在连续反应过 程中保持旺盛的生长、繁殖的一种固定化方法。
特点：
① 细胞密度增大； ② 繁殖使酶不断更新；
③ 反应酶处于天然环境中，更加稳定
④ 扩散阻力增大 ⑤ 能利用整套代谢途径生产代谢产物
2018/8/5
固定化酶的缺点
① 固定化时，酶活力有损失； ② 增加了生产成本，工厂初 始投资大； ③ 只能用于可溶性底物，而 且较适用于小分子底物， 对大分子不适宜； ④ 与完整菌体相比不适宜于 多酶反应； ⑤ 胞内酶必须先进行分离
第9章 酶的固定化技术
7
第二节 酶的固定化方法
一、固定化酶制备的基本原则
1、将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应 2、在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
14
（1）与载体共价结合的酶功能团
酶 N端α-氨基、赖氨酸ε-氨基； 酶 C端α-羧基、天冬氨酸的β-羧基、谷氨酸的γ羧基；
半胱氨酸残基的巯基；
丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的羟基；
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
23
（四）细胞固定化方法
1、吸附法：
通过载体与细胞间的静电引力、分子间作用力、 离子键和氢键等作用力，使细胞吸附到载体上。
2、包埋法：
常用凝胶包埋法，如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸
钙凝胶、卡拉胶等。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
24
各类固定化方法的特点比较
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
30
二、固定化酶性质的变化
1、固定化对酶活力的影响：
一般来说，固定化酶的活力比游离酶低。
原因：
构象效应:载体与酶关键位点氨基酸残基发生作用，使 酶活性中心或调控中心发生构象变化；
屏蔽效应：载体的空间位阻使底物与酶无法正常结合； 分配效应和扩散效应：酶催化区域底物浓度低或产物 无法及时排出而造成产物抑制。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
32
二、固定化酶性质的变化
3、最适温度的变化：
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速率综 合作用的结果。固定化使酶的热稳定性提高，所 以最适温度一般也随之升高。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
33
二、固定化酶性质的变化
3、最适pH的变化：酶活力-pH曲线发生偏移
缺点：酶与载体结合力弱，离子强度高酶易脱落
固定化载体：
阴离子交换剂：DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶等
阳离子交换剂：CM-纤维素、AmberliteCG-50等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
13
（一）载体结合法
3、共价结合法：酶通过共价键结合于水不溶性载 体的固定化方法 两类方法：
缺点：反应激烈，酶活回收率低
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
18
（三）包埋法
将酶包埋在各种多孔载体中，使酶固定化。分 为网格型和微囊型两种。
• 网格型：酶包埋在高分子凝胶细微网格中
• 微囊型：酶包埋在高分子半透膜中
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
19
三、细胞的固定化
固定化细胞：
① 载体电荷性质的影响。
带负电荷的载体吸引溶液中的H+，使微环境偏酸
带正电荷的载体吸引溶液中的OH-，使微环境偏碱
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
34
二、固定化酶性质的变化
② 产物酸碱性的影响
由于扩散障碍，反应产物向外扩散受到限制， 产物滞留在固定化酶催化区域。
产物呈酸性时，催化区域 pH 降低，需要提高宏观环境 pH，才能达到酶所要求的最适pH，表观最适pH变大； 产物呈碱性时，催化区域 pH 升高，需要降低宏观环境 pH，才能达到酶所要求的最适pH，表观最适pH变小；
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
6
四、固定化酶的特点
固定化酶的优点
① 极易将固定化酶与底物、 产物分开，有利于酶的回 收和产物的纯化； ② 大多数情况下，能够提高 酶的稳定性； ③ 能够反复使用，有利于降 低生产成本； ④ 能与多种反应器结合，实 现连续化、自动化生产； ⑤ 比游离酶更适合多酶反应
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
31
二、固定化酶性质的变化
2、固定化对酶稳定性的影响：
大多数情况下，固定化使酶的稳定性提高。表 现在热稳定性、 pH稳定性、抗降解能力、抗抑制 剂和变性剂能力等的提升。
原因： ① 酶与载体多点连接，使酶分子结构的刚性增强，可防 止酶的伸展变性； ② 固定化酶内的微孔结构使蛋白酶、变性剂、抑制剂等 难以进入固定化酶内部与酶分子结合；
活性剂处理等。 特点：
① 细胞膜通透性增强； ② 能抑制副反应； ③ 适合单酶催化反应
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
21
三、细胞的固定化
（二）固定化静息细胞：
细胞固定化后由于缺乏营养物质，不进行生长 繁殖而处于静息状态。 特点：
① 适合多酶催化反应，特别是需要辅酶的反应；
② 底物和产物扩散阻力增大；
组氨酸残基的咪唑基；
色氨酸残基的吲哚基；
苯丙氨酸和酪氨酸残基上的苯环
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
15
（2）常用载体
天然有机载体：多糖、蛋白质等
无机载体：玻璃、陶瓷等
合成聚合物：聚酯、聚胺、尼龙等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
16
（3）共价结合法特点
优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，利于 连续使用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
27
一、引起固定化酶变化的因素
3、微扰效应：
由于载体固有的性质使紧邻固定化酶的区域发生微环境 变化，使酶的催化能力及酶对效应物（抑制剂、激活剂等） 做出调节反应的能力发生改变，称为微扰效应。
与载体的亲水性及电荷性质有关
微环境：围绕载体的液膜层
（边界层）及酶的催化区域 宏观环境：主体溶液
③ 产物难分离
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
4
二、固定化酶
固定化酶的定义
指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
5
三、固定化酶的发展历程
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的 Grubhofer 和 Schleith采用聚氨基苯乙烯 树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、 胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。
吸附法 比较项目 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 适用性 易 弱 较高 可能 低 不变 酶源多 .共价键结合 难 强 低 不可能 高 可变 较广 离子键结合 易 中等 高 可能 低 不变 广泛 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较广 较难 强 高 不可能 低 不变 结合法 交联法 包埋法
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
37
三、固定化酶的评价
2、固定化酶的比活力：
固定化酶颗粒的比活力用每克固定化酶具有的 酶活力单位来表示，单位U/g
固定化的酶膜、酶管、酶板，以单位面积具有 的酶活力单位表示，单位U/cm2
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
38
三、固定化酶的评价
3、偶联率与酶活回收率：
利用物理或化学手段，将具有一定生理功能的 生物细胞限制或定位在特定区域，作为可重复使
用的生物催化剂而加以利用的一门技术。
• 固定化死细胞 • 固定化活细胞
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
20
三、细胞的固定化
（一）固定化死细胞：
固定化之前或之后，细胞经过物理或化学方法 的处理，如加热、破碎、干燥、冷冻、酸及表面
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
28
一、引起固源自文库化酶变化的因素
4、分配效应：
由于载体的疏水性及带电特征，使底物、产物或其他效 应物在固定化酶所处的微环境和宏观环境间发生不等分配， 改变酶反应系统的组成平衡，从而影响反应速率。
带电特性影响：载体与底物、产物的静电相互作用
载体与底物带同种电荷，底物在微环境中分配少，浓度低； 带异种电荷，底物在微环境中分配多，浓度高。
小分子底物、 药用酶
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
25
第三节 固定化酶的性质及评价
一、引起固定化酶变化的因素
1、构象效应：
酶在固定化过程中，由于酶与载体 相互作用使酶的活性中心或变构中心发 生变化，从而导致了酶与底物结合能力 降低，酶的活性下降。
2、屏蔽效应（位阻效应）：
酶经固定化后，载体成为底物结合 到活性中心或变构中心的空间障碍，酶 与底物的结合能力减弱，从而降低酶的 催化活性。
偶联率：用于固定化的蛋白活力占加入蛋白总 活力的百分数。 加入的蛋白活性-上清液蛋白活性 偶联率= 100% 加入的蛋白活性
缺点：反应条件苛刻，操作复杂；
可能引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分
活性中心；酶活回收率低。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
17
（二）交联法
交联法：使用双功能或多功能试剂使酶与酶之 间交联的固定化方法。利用共价键使酶结合， 不使用载体。 交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等 酶的结合基团：酶N端α-氨基、赖氨酸ε-氨基、酪氨 酸酚基、半胱氨酸巯基和组氨酸咪唑基等 优点：结合牢固，可长期多批使用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
35
二、固定化酶性质的变化
4、固定化对底物特异性的影响：
底物特异性的实质是酶对不同底物的催化活性有 差异，固定化酶的底物特异性与载体的孔径和底 物的相对分子质量有关。
小分子底物受空间位阻影响小，能与酶催化区域正常 结合，酶促反应速率不受影响；
固定化介质阻碍大分子底物与酶催化区域的结合，从 而使酶促反应速率下降。
1、必须维持酶的催化活性及专一性
酶与载体的结合部位不应是酶的活性部位
避免能使酶的高级结构被破坏的不利因素
2、酶与载体应牢固结合 3、具备一定的机械强度，能反复使用 4、应有尽可能小的空间位阻 5、固定化载体不参加化学反应 6、成本要低，利于工业化应用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
9
二、酶的固定化方法
缺点：酶与载体结合力弱，酶易脱落
固定化载体：
无机载体：活性炭、多孔玻璃、金属氧化物、硅胶等；
有机载体：淀粉、纤维素、骨胶原等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
12
（一）载体结合法
2、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不溶性载体的固定化方法 优点：酶活性中心不易破坏，酶活回收率高
酶工程
第九章 酶的固定化技术
主要内容
1 2 3 4
固定化酶及其特点 酶的固定化方法 固定化酶的性质及评价 固定化酶反应器
第一节 固定化酶及其特点
一、均相酶反应
均相酶反应
游离酶溶解在水相中，形成均一的溶液后进行 的催化反应。 均相酶反应系统的缺陷：
① 稳定性差，易变性
② 难回收，不利于连续化反应
第9章 酶的固定化技术
36
三、固定化酶的评价
1、固定化酶的活力：
固定化酶的催化活力表征催化某一化学反应的 能力。可用一定条件下催化某一反应的初速度来 表示。
固定化酶颗粒：每毫克每分钟转化底物或生成产物的 量，表示为 μmol/(min· mg)；
固定化的酶膜、酶管、酶板，以单位面积的反应初速 率来表示，表示为 μmol/(min· cm2) 。
离子结合
共价结合
交联
聚合物包埋
疏水相互作用
脂质体包埋
微胶囊
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
10
二、酶的固定化方法
酶固定化的方法：
载体结合法 交联法 包埋法
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
11
（一）载体结合法
1、通过氢键、疏水性相互作用、静电作用等物理 作用，将酶吸附于不溶性载体的固定化方法。 优点：酶活性中心不易破坏，酶高级结构变化小
疏水性：载体与底物或产物的疏水作用
思考：载体疏水性和底物极性怎样影响底物的分配？
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
29
一、引起固定化酶变化的因素
5、扩散限制效应：
底物、产物或其他效应物在固定化酶微环境与宏观环境 之间迁移或运转速度受到限制的一种效应，使上述物质在 这些区域的分布不等。
底物和产物的传质过程
20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展
1969年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固 定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，实现了酶应 用史上的一大变革。 在 1971 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用 “ 固 定 化 酶 ” （ immobilized enzyme ） 的 名 称 。
③ 与固定化死细胞相比稳定性提高
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
22
三、细胞的固定化
（三）固定化活细胞：
将活细胞固定在载体上，并使其在连续反应过 程中保持旺盛的生长、繁殖的一种固定化方法。
特点：
① 细胞密度增大； ② 繁殖使酶不断更新；
③ 反应酶处于天然环境中，更加稳定
④ 扩散阻力增大 ⑤ 能利用整套代谢途径生产代谢产物
2018/8/5
固定化酶的缺点
① 固定化时，酶活力有损失； ② 增加了生产成本，工厂初 始投资大； ③ 只能用于可溶性底物，而 且较适用于小分子底物， 对大分子不适宜； ④ 与完整菌体相比不适宜于 多酶反应； ⑤ 胞内酶必须先进行分离
第9章 酶的固定化技术
7
第二节 酶的固定化方法
一、固定化酶制备的基本原则
1、将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应 2、在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
14
（1）与载体共价结合的酶功能团
酶 N端α-氨基、赖氨酸ε-氨基； 酶 C端α-羧基、天冬氨酸的β-羧基、谷氨酸的γ羧基；
半胱氨酸残基的巯基；
丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的羟基；
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
23
（四）细胞固定化方法
1、吸附法：
通过载体与细胞间的静电引力、分子间作用力、 离子键和氢键等作用力，使细胞吸附到载体上。
2、包埋法：
常用凝胶包埋法，如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸
钙凝胶、卡拉胶等。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
24
各类固定化方法的特点比较
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
30
二、固定化酶性质的变化
1、固定化对酶活力的影响：
一般来说，固定化酶的活力比游离酶低。
原因：
构象效应:载体与酶关键位点氨基酸残基发生作用，使 酶活性中心或调控中心发生构象变化；
屏蔽效应：载体的空间位阻使底物与酶无法正常结合； 分配效应和扩散效应：酶催化区域底物浓度低或产物 无法及时排出而造成产物抑制。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
32
二、固定化酶性质的变化
3、最适温度的变化：
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速率综 合作用的结果。固定化使酶的热稳定性提高，所 以最适温度一般也随之升高。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
33
二、固定化酶性质的变化
3、最适pH的变化：酶活力-pH曲线发生偏移
缺点：酶与载体结合力弱，离子强度高酶易脱落
固定化载体：
阴离子交换剂：DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶等
阳离子交换剂：CM-纤维素、AmberliteCG-50等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
13
（一）载体结合法
3、共价结合法：酶通过共价键结合于水不溶性载 体的固定化方法 两类方法：
缺点：反应激烈，酶活回收率低
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
18
（三）包埋法
将酶包埋在各种多孔载体中，使酶固定化。分 为网格型和微囊型两种。
• 网格型：酶包埋在高分子凝胶细微网格中
• 微囊型：酶包埋在高分子半透膜中
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
19
三、细胞的固定化
固定化细胞：
① 载体电荷性质的影响。
带负电荷的载体吸引溶液中的H+，使微环境偏酸
带正电荷的载体吸引溶液中的OH-，使微环境偏碱
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
34
二、固定化酶性质的变化
② 产物酸碱性的影响
由于扩散障碍，反应产物向外扩散受到限制， 产物滞留在固定化酶催化区域。
产物呈酸性时，催化区域 pH 降低，需要提高宏观环境 pH，才能达到酶所要求的最适pH，表观最适pH变大； 产物呈碱性时，催化区域 pH 升高，需要降低宏观环境 pH，才能达到酶所要求的最适pH，表观最适pH变小；
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
6
四、固定化酶的特点
固定化酶的优点
① 极易将固定化酶与底物、 产物分开，有利于酶的回 收和产物的纯化； ② 大多数情况下，能够提高 酶的稳定性； ③ 能够反复使用，有利于降 低生产成本； ④ 能与多种反应器结合，实 现连续化、自动化生产； ⑤ 比游离酶更适合多酶反应
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
31
二、固定化酶性质的变化
2、固定化对酶稳定性的影响：
大多数情况下，固定化使酶的稳定性提高。表 现在热稳定性、 pH稳定性、抗降解能力、抗抑制 剂和变性剂能力等的提升。
原因： ① 酶与载体多点连接，使酶分子结构的刚性增强，可防 止酶的伸展变性； ② 固定化酶内的微孔结构使蛋白酶、变性剂、抑制剂等 难以进入固定化酶内部与酶分子结合；
活性剂处理等。 特点：
① 细胞膜通透性增强； ② 能抑制副反应； ③ 适合单酶催化反应
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
21
三、细胞的固定化
（二）固定化静息细胞：
细胞固定化后由于缺乏营养物质，不进行生长 繁殖而处于静息状态。 特点：
① 适合多酶催化反应，特别是需要辅酶的反应；
② 底物和产物扩散阻力增大；
组氨酸残基的咪唑基；
色氨酸残基的吲哚基；
苯丙氨酸和酪氨酸残基上的苯环
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
15
（2）常用载体
天然有机载体：多糖、蛋白质等
无机载体：玻璃、陶瓷等
合成聚合物：聚酯、聚胺、尼龙等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
16
（3）共价结合法特点
优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，利于 连续使用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
27
一、引起固定化酶变化的因素
3、微扰效应：
由于载体固有的性质使紧邻固定化酶的区域发生微环境 变化，使酶的催化能力及酶对效应物（抑制剂、激活剂等） 做出调节反应的能力发生改变，称为微扰效应。
与载体的亲水性及电荷性质有关
微环境：围绕载体的液膜层
（边界层）及酶的催化区域 宏观环境：主体溶液
③ 产物难分离
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
4
二、固定化酶
固定化酶的定义
指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
5
三、固定化酶的发展历程
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的 Grubhofer 和 Schleith采用聚氨基苯乙烯 树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、 胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。
吸附法 比较项目 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 适用性 易 弱 较高 可能 低 不变 酶源多 .共价键结合 难 强 低 不可能 高 可变 较广 离子键结合 易 中等 高 可能 低 不变 广泛 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较广 较难 强 高 不可能 低 不变 结合法 交联法 包埋法
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
37
三、固定化酶的评价
2、固定化酶的比活力：
固定化酶颗粒的比活力用每克固定化酶具有的 酶活力单位来表示，单位U/g
固定化的酶膜、酶管、酶板，以单位面积具有 的酶活力单位表示，单位U/cm2
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
38
三、固定化酶的评价
3、偶联率与酶活回收率：
利用物理或化学手段，将具有一定生理功能的 生物细胞限制或定位在特定区域，作为可重复使
用的生物催化剂而加以利用的一门技术。
• 固定化死细胞 • 固定化活细胞
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
20
三、细胞的固定化
（一）固定化死细胞：
固定化之前或之后，细胞经过物理或化学方法 的处理，如加热、破碎、干燥、冷冻、酸及表面
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
28
一、引起固源自文库化酶变化的因素
4、分配效应：
由于载体的疏水性及带电特征，使底物、产物或其他效 应物在固定化酶所处的微环境和宏观环境间发生不等分配， 改变酶反应系统的组成平衡，从而影响反应速率。
带电特性影响：载体与底物、产物的静电相互作用
载体与底物带同种电荷，底物在微环境中分配少，浓度低； 带异种电荷，底物在微环境中分配多，浓度高。
小分子底物、 药用酶
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
25
第三节 固定化酶的性质及评价
一、引起固定化酶变化的因素
1、构象效应：
酶在固定化过程中，由于酶与载体 相互作用使酶的活性中心或变构中心发 生变化，从而导致了酶与底物结合能力 降低，酶的活性下降。
2、屏蔽效应（位阻效应）：
酶经固定化后，载体成为底物结合 到活性中心或变构中心的空间障碍，酶 与底物的结合能力减弱，从而降低酶的 催化活性。
偶联率：用于固定化的蛋白活力占加入蛋白总 活力的百分数。 加入的蛋白活性-上清液蛋白活性 偶联率= 100% 加入的蛋白活性
缺点：反应条件苛刻，操作复杂；
可能引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分
活性中心；酶活回收率低。
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
17
（二）交联法
交联法：使用双功能或多功能试剂使酶与酶之 间交联的固定化方法。利用共价键使酶结合， 不使用载体。 交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等 酶的结合基团：酶N端α-氨基、赖氨酸ε-氨基、酪氨 酸酚基、半胱氨酸巯基和组氨酸咪唑基等 优点：结合牢固，可长期多批使用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
35
二、固定化酶性质的变化
4、固定化对底物特异性的影响：
底物特异性的实质是酶对不同底物的催化活性有 差异，固定化酶的底物特异性与载体的孔径和底 物的相对分子质量有关。
小分子底物受空间位阻影响小，能与酶催化区域正常 结合，酶促反应速率不受影响；
固定化介质阻碍大分子底物与酶催化区域的结合，从 而使酶促反应速率下降。
1、必须维持酶的催化活性及专一性
酶与载体的结合部位不应是酶的活性部位
避免能使酶的高级结构被破坏的不利因素
2、酶与载体应牢固结合 3、具备一定的机械强度，能反复使用 4、应有尽可能小的空间位阻 5、固定化载体不参加化学反应 6、成本要低，利于工业化应用
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
9
二、酶的固定化方法
缺点：酶与载体结合力弱，酶易脱落
固定化载体：
无机载体：活性炭、多孔玻璃、金属氧化物、硅胶等；
有机载体：淀粉、纤维素、骨胶原等
2018/8/5
第9章 酶的固定化技术
12
（一）载体结合法
2、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不溶性载体的固定化方法 优点：酶活性中心不易破坏，酶活回收率高
酶工程
第九章 酶的固定化技术
主要内容
1 2 3 4
固定化酶及其特点 酶的固定化方法 固定化酶的性质及评价 固定化酶反应器
第一节 固定化酶及其特点
一、均相酶反应
均相酶反应
游离酶溶解在水相中，形成均一的溶液后进行 的催化反应。 均相酶反应系统的缺陷：
① 稳定性差，易变性
② 难回收，不利于连续化反应