猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展

猪流行性腹泻病毒S基因的研究进展
摘要：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，是导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。

近年来，猪流行性腹泻的流行区域有扩大的趋势，已成为中国甚至全世界最常见的猪腹泻传染病之一。

通过对猪流行性腹泻病毒的基因组概述，S基因及其编码蛋白的功能特性、基于猪流行腹泻病毒S基因的诊断技术及其疫苗研究进展等方面的进行综述。

关键词：猪流行性腹泻病毒；S 基因；S 蛋白；诊断技术；疫苗进展
Abstract:Swine epidemic diarrhea is an acute intestinal infection caused by porcine epidemic diarrhea virus, which is one of the important diseases that lead to the early death of piglets. In recent years, epidemic areas of swine epidemic diarrhea have been expanding and have become one of the most common porcine diarrhea-related diseases in China and even in the world. This review summarizes the genome of Swine Epidemic Diarrhea virus and the functional properties of S gene and its encoded protein based on the diagnostic technique of S gene of swine epidemic diarrhea virus and the research progress of its vaccine.
Keywords:Porcine epidemic diarrhea virus; S gene; S protein; diagnostic technique; vaccine progression
引言
20世纪70年代初，猪流行性腹泻（PED）在欧洲等国如英国、荷兰、比利时和捷克就被发现，被认定为一种急性肠道传染病，其主要特点为腹泻、脱水以及呕吐。

1977年，成功的分离到这种冠状病毒并命名为流行性腹泻病毒（PEDV）。

与欧洲等国同时期，我国也出现了新生仔猪的严重腹泻并死亡的事件，采用各种抗生素均无效果，当时被认为是胃肠炎的传染病。

到了20世纪80年代初，采用酶标法证明了这种流行病为猪流行性腹泻病毒[1]~[3]。

PED目前在全球范围内流行广泛，特别是在亚洲国家如中国、日本和韩国，这已经给养猪业带来了严重的冲击。

现已表明猪流行性腹泻主要是由于猪流行性腹泻病毒导致的一种急性的肠道传染病。

PEVD可以导致不同年龄以及不同品种的猪染病引起严重的腹泻，例如成年母猪20%～85%发病，架子猪、哺乳仔猪以及育肥猪100%的发病。

主要病症为：症状轻的为日龄大，症状重的为日龄小。

具体表现为：成年猪表现为厌食与呕吐，育肥猪和断奶猪的腹泻仅持续7 d左右，
症状较轻。

而日龄较小的哺乳仔猪死亡率达到50%，出现严重的脱水症状。

PEDV 属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，引起的病症日趋复杂，经常出现交叉感染的情况，PED造成猪的整齐度差、成活率减少、减缓生长速度、推迟上市时间、病毒的易感性、增重减少、增加额外消耗、降低饲料利用率、降低牲畜抗病力、增加对细菌并增加发病率，提高治疗费用、猪拉稀体重下降、休克、死亡、牲畜脱水等十分严重的后果，因此需要引起从业人员的高度重视[5]。

１PEDV的基因组研究
PEDV基因组属于单股正链感染性的RNA，基因组全长28Kb左右，与其他冠状病毒相似，在基因组5’端有一个帽子结构（cap），基因组5′非翻译区（5’URT）长度为300bp左右[6]~[8]。

3′端有一个polyA尾，基因组3’非翻译区（3’URT）长度为330bp 左右，剩余的基因组包括6个开放阅读框（OFR），从5’→3’端依次为ORF1（20000bp左右）、S基因（4100bp左右）、ORF3（670bp左右）、E基因（230bp左右）、M基因（680bp 左右）、N基因（1300bp左右）。

PEDV基因主要编码结构蛋白分别为S蛋白、E 蛋白、M蛋白、N蛋白。

Ｓ蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白[9]，由1383个氨基酸组成，含有29个潜在的糖基化位点，同其他冠状病毒相似。

E 蛋白是最小的结构蛋白，该蛋白位于病毒粒子的囊膜上，氨基酸包埋在脂质双层中且N-端朝向病毒粒子的外部，-OH位于粒子内部，单次跨膜。

M 蛋白是由226个氨基酸组成、分子质量为27-32Ku之间的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用［9］。

N 蛋白由441个氨基酸组成，分子质量为55-58Ku，其中含有6-7个丝氨酸磷酸化位点，是PEDV已知结构蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是组成病毒核衣壳的结构基础，在病毒基因组的转录复制中起重要作[10]。

2 S基因
S基因编码病毒的纤突蛋白，该基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成，而是翻译分子质量为1383个氨基酸编码的多肽。

S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4143bp～4161bp之间[11]~[13]。

目前，关于PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一个依据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1-1、G1-2 和G2-1、G2-2。

研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象（以基因插入为主）；
而G2基因群则不同，其主要存在有碱基缺失（3bp或6bp）现象[14]。

氨基酸分析表明，G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。

G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777（G2基因群代表株）的同源性为93.0％～93.8％[15]-[18]。

由于PEDV 只有一个血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用密切相关。

对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失（197aa）和插入（4aa），表明随着疫苗的使用，PEDV 基因组进化趋势增强[18]。

以S 基因绘制PEDV 遗传进化树发现，PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株，主要在韩国、美国等地流行[19]-[21]。

3 S 蛋白
S 蛋白是由1 383个氨基酸组成、分子质量为180 ~220 ku、位于病毒粒子表面的纤突蛋白，它在识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合中发挥重要地生物学作用[22]~[23]。

由于含有PEDV 主要的抗原决定簇，有很好的免疫原性，故在机体的抗病毒免疫中起重要[24]，且它在结构蛋白中的含量最高，用其制备的免疫血清是病毒抗原检测试剂的良好择[24]。

S 蛋白缺乏蛋白水解位点，而TGEV 在此位点上可产生氨基和羧基亚单位S1 S2。

序列比较分析证实PEDV 同HCV229E 抗原相关。

但PEDV 还另外有250个残基的N端区，而这是HCV229E 和TGEV 的呼吸道变异株PRCV 所缺乏的[25]~[27]。

尽管S 蛋白在感染过程不被切割成S1 和S2 亚基，但是在相对应的位置上存在这2个基序，这为PEDV S蛋白的受体结合域、抗原区( S1 区) 和膜融合区( S2 区) 的人为划分提供了依据[28]。

其中S蛋白的C端有一疏水残基链(1 322~1 337个氨基酸)，预测在此处可形成α螺旋，起着膜受体的作用。

孙东波等[27]对已知冠状病毒S 蛋白抗原表位和抗原表位区进行了分析，发现目前已经鉴定的冠状病毒S蛋白抗原表位主要位于S蛋白N2 端1 /2 的区域，结果在
S蛋白Sl区83 ~276 氨基酸区域预测到1个抗原表位区。

此外，S 蛋白有27 ~29 个潜在的糖基化位点，在p H 4. 0 低渗非离子溶剂中溶解度最大[29]~[31]。

其在病毒粒子成熟后不能被细胞蛋白酶切割，这样就降低了病毒的细胞融合力和感染力，这也是PEDV人工细胞培养困难的原因。

4基于PEDV S基因的诊断技术
由于PED 与TGE 有着极为相似的临床症状和病理变化,因此确诊PED需要结合实验室诊断方法。

目前，用于PEDV检测的方法有许多，比如病毒分离、免疫电镜观察、病毒的中和试验、免疫荧光技术等，这些方法均能对PED做出准确的诊断,但这些技术操作复杂而且耗时[32]~[34]。

病毒与宿主细胞吸附和受体识别的主要蛋白之一是S蛋白，且S蛋白具良好的反应原性和免疫原性，因此在免疫学诊断技术中应用较广[35]。

有研究表明，用N 蛋白和S蛋白建立ELISA 方法分别进行比较探索，发现在免疫测定中S-ELISA 法更为有效。

研究发现，猪感染猪流行性腹泻后，检测到血清中的抗N 蛋白抗体远不及抗S 蛋白抗体，可在更长的时间中检测到抗S 蛋白的抗体[36]~[38]。

随着人们对ELISA 方法不断地深入研究, 该方法被广泛地应用到临床实践中，此方法可用于检测抗体，也可检测抗原，相比较其他检测方法，更为简便、敏感。

Gerber等[39]根据PEDV S1 蛋白的生物学特性建立了间接ELISA方法，对检测Ig A和Ig G 抗体都具有良好的特异性和敏感性。

Paudel 等[40]根据PEDV S基因分别表达的S1蛋白、S2 蛋白、S3 蛋白，分别建立了ELISA 方法，对400 头免疫疫苗的猪血清进行抗体水平检测，与血清中和试验(SN) 相比、S3 基因表达蛋白建立的ELISA 方法更符合SN，表明S3 基因是重要的中和抗原基因, 在遗传免疫中起着重要作用[41]。

Ishikawa等[42]根据S基因序列设计了一对特异性引物，扩增出854bp 大小的目的片段,成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR 法。

S基因保守区域也可以作为检测靶点[43]~[44]。

5基于S基因的疫苗研究进展
将PEDV 的S基因在烟草中进行表达，将提取的转基因植物蛋白给小鼠注射，然后进行血清蚀斑减数中和测定，试验结果证明S基因具有良好的免疫原性，通过用这种转基因烟草饲喂小鼠，发现其能够刺激小鼠产生系统免疫和黏膜免疫[45]~[47]。

以烟草花叶病毒为载体将S蛋白中和表位在无烟碱烟草中进行表达，表达蛋白接种仔猪，发现能够诱导仔猪机体产生保护性免疫反应。

这些研究成果为PEDV转基因疫苗的开发与研究奠定了一定基础，但是研究发现，转基因植物自身表达抗原的效率过低，并且其生物安全性也有待进一步考究[38]。

通过以重组腺病毒和重组沙门氏菌作为活载体，构建的PEDV疫苗能够针对病毒，产生有效
地全身免疫反应和局部黏膜免疫应答[48]。

以重组PEDV S1蛋白和N蛋白的干酪乳杆菌给猪和小鼠口服，虽然不能够诱导机体产生中和抗体，但却能激发高水平局部黏膜IgA抗体和非中和抗体的全身免疫反应。

由于活载体疫苗存在生物安全性、遗传稳定性尚未确定的缺点，因此国际上商品化的活疫苗不常见[49]。

赵德等将PEDV S基因中具有保护性的C-COE基因片段与乳酸菌重组后进行小鼠免疫，前两次间隔1周免疫1次，共进行3次免疫，最后一次免疫间隔2周后进行PEDV抗体检测，试验结果显示以乳酸菌载体制备的疫苗，能刺激机体产生特异性抗体，此外，口服免疫途径比注射产生高水平的抗体更容易，进一步证实乳酸菌载体疫苗更适宜于口服免疫[50]。

焦茂兴等将含有PEDV疫苗株的sM、M、S基因与腺病毒进行重组构建了重组腺病毒,研制了PED口服重组腺病毒疫苗。

6总结
目前对PEDV S基因的研究，主要集中在基因结构分析及功能预测、蛋白免疫原性分析、遗传进化分析等方面。

经重组菌或重组病毒等多种形式表达的S基因的多个保守性中和抗原表位，在经过以小鼠作为动物模型的试验中表现出良好的免疫原性的优势，但同时也存在不少令人担忧的问题，例如，重组菌或重组蛋白诱导细胞和体液免疫水平不够显著，与传统疫苗相比存在保护效力不足的缺点，新型诊断方法或疫苗在临床实践应用较少等[51]。

此外，虽已证实pAPN为PEDV细胞受体，但关于S蛋白与pAPN受体结合后如何进行一系列信号转导促使细胞膜重排和融合等机制还需进一步研究来揭示。

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