实验一蛋白质定量测定

写要求结构完整、条理分明、文字简炼、书写工整、措词推理符合科学性、逻辑性。具体 格式如下： ．实验名称 姓名 学号 班级 ．目的要求 . 原理 . 主要试剂和仪器 ．操作方法： ．实验结果：是实验报告的重要部分，一般要列出经过归纳整理的结果，并将实验数据列 表说明，若为图形资料，应做好标记及剪贴。 ．讨论：要针对实验中所观察到的现象与结果而言，注意不要离开实验的实际去空谈理论 或照抄书本。要判断结果是否为预期的，属于非预期的，要认真分析原因。
优点
费时间较长，要精确 控制操作时间，标准 曲线不是严格的直线 形式，专一性较差，
干扰物质较多
缺点
试验结果的干扰因素
缓冲液
蔗糖
尿素
胍 硫酸钠
干扰物质
硫酸胺
三氯乙酸
乙醇
酚类
丙酮
柠檬酸
为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘
制标准曲线。
三 试剂与器材
器材 [] 试管及试管架 [] 移液管(、、)、移液枪（,用于样品蛋白质） [] 型分光光度计 [] 电热恒温水浴
蛋白质(g)/ 100ml血清 ＝A640值对应标准曲线蛋白质含量＊10 -6 血清稀释倍数＊100 测定时用稀释血清的ml数
分光光度计：
.开电源预热分钟
.调波长
.用黑体调值(透光率） 为
.用对照管的溶液调 值（吸光率）为。
.测各浓度的标准蛋 白质和血清蛋白质的 值。
【思 考 题】
1.酚法进行蛋白定量测定的优缺点。 2.常用的蛋白质含量测定方法在哪些？
一目的要求
学习酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质 含量。
二原 理 、
. 凯氏微量定氮法
. 紫外分光光度法
. 双缩脲法 . —酚试剂法(法)
微量凯氏定氮法
含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被 氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，氨又与硫酸作用， 变成硫酸氨。此过程通常称为“消化”。强碱使硫酸铵 分解游离出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸 液中和的程度，计算样品的含氮量。 本法适用范围氮，相对误差应小于。
试剂 [] 标准酪蛋白溶液：μ／的标准酪蛋白溶液。 [] —酚试剂甲 [] —酚试剂乙 [] 血清：稀释倍。
甲由下述四种溶液配制 ()％碳酸钠溶液； ()氢氧化钠溶液； ()％硫酸铜(· )溶液； ()％酒石酸钾钠溶液。 在使用前，将()与()等体积混合配成碳酸钠—氢氧化钠溶液，将()与()
等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液 按的比例混合，即为—酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
实验一蛋白质的定量测定 ——酚试剂法(法)
实验室规则 一、学生必须服从老师的指导，按照实验目的、要求和方法做
好充分准备，进行实验。 二、保持实验室内安静、整洁，有秩序地进行工作。 三、按照操作规程(规则)进行实验，正确地据实将实验数据等情
况填写在规定的记录本上。 四、节约实验材料和水电，按规定的数量取用原料和试剂。 五、爱护仪器设备，实验完毕时，负责清洗干净，并按规定要 求存放原处；仪器设备如有损坏，应立即报告老师，同时向
蒸馏水 酚甲
混匀后度水浴锅中放置
酚乙
() 蛋白质浓度 (µ )
加乙后立即摇匀，室温下放置分钟后以号试管为空白对照，在处比色
制作标准曲线：以为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标 标准蛋白浓度标准液()×标准液浓度（μ）
.血清蛋白质浓度的测定
取支试管，各加入一定量的血清稀释液(已经稀释倍，其蛋白质含量在 酪蛋白标准曲线范围之内)，本实验取血清稀释液，再加入蒸馏水使 样品体积达到。其他操作与“标准曲线的制作”相同。
由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此 也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。 通常可用此法来定性鉴定蛋白质的存在。 也可根据反应生成颜色的深浅，在波长处进行比色，定量测 定蛋白质的浓度。 允许测定范围为～ 蛋白质。 除有此反应外，（）、（）、（）、（）等基团亦有此反应。

—酚法(法)
碱性条件下蛋 白质中的肽键 与铜盐溶液作
用生成铜
－蛋白质络合 物
碱性条件下 蛋白质中酪 氨酸的酚基 使磷钨酸— 磷钼酸还原 成兰色复合
物
显色反应，兰色。，，，，
在一定条件下，兰色强度与蛋白质的量成正比例。
2020/8/16
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优缺点
可检测的最低蛋白质量达 µ ，通常测定范围 是µ
操作简便 灵敏度高
乙 在的磨口廻流装置内加入钨酸钠(· )，钼酸钠(· )，蒸馏水，％磷酸 和浓盐酸，充分混合后，以小火廻流。再加入硫酸锂()，蒸馏水及数 滴液体溴。然后，开口继续沸腾，以驱除过量的溴。冷却后定容到， 过滤，滤液呈绿色。
四 操作步骤
.标准曲线的制作
取支试管
反应物 ()
（空白对照 管）
蛋白质标准溶液 (µ )
取支试管
反应物 ()
（空白对照 管）
血清稀释液 (已经稀 释倍)
蒸馏水
酚甲
混匀后度水浴锅中放置
酚乙
() 蛋白质浓度 ()
加乙后立即摇匀，分钟后以号试管为空白对照，在处比色
、数据处理
、绘制标准曲线：以为纵坐标，标准蛋白含量为横 坐标，在坐标纸上或用绘制标准曲线。 、计算特测蛋白浓度：用待测蛋白质的从标准曲线 上查出其对应的蛋白含量，据实验中所加入的待测 蛋白质的体积计算其浓度。
紫外分光光度法
蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共 轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸 收高峰在 波长处。紫外吸收法在蛋白质含量µ内 服从比尔定律。
双缩脲法
在碱性条件下,具有两个以上肽键的物质能与双缩脲试剂的铜离子 （）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），颜色深 浅与肽键的多少即蛋白质含量成正比。
管理人员说明情况，按规定办好报损或赔偿手续。 六、实验室内严禁吸烟，不准带入食品，不准会客。 七、不遵守实验室规则的应给予批评教育；对于严重违反操作 规程并造成重大损失者，除赔偿损失外，并视情节轻重给予
实验报告的书写 实验报告是对实验结果的科学总结。书写实验报告是培养和提高文字表达能力 及概括综合分析问题能力的重要训练方法。每次实验后要求写好实验报告。实验报告的书