microRNA在结肠癌组织的表达及其临床意义

肠癌的发展有着密切的联系，并且其可以作为一个有效的肿瘤标志物以进行结肠癌的早期预测和
诊断。
【关键词】ｍｉＲＮＡ；结肠癌；肿瘤标志物
ｈ咖ｎ∞Ｉｏｎ Ｄｅｔ剃ｏｎ ｏｆ Ｉｎｉ啪ＲＮＡｓ ｄｕｓｔｅｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒ酷ｓｉｏｎ ｉｎ
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ｍｉＲ—ｌＯｂ、ｍｉＲ—１６、ｍｉＲ．１７－３ｐ、ｍｉＲ－１７－５ ｐ、ｍｉＲ一１８ａ、ｌｌｌｉＲ—
１９ａ、ｍｉＲ＿２０ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ以、ｍｉＲ－２５、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－
３ｌ、ｍｉＲ一３４ａ、ｍｉＲ．９２、ｍｉＲ－９３、ｍｉＲ一１０３、ｍｉＲ一１０６ａ、ｍｉＲ— １０６ｂ、ｍｉＲ—１０７、ｍｉＲ．１２６宰、ｍｉＲ一１２８ａ、ｍｉＲ—１２８ｂ、ｍｉＲ一 １３２、ｍｉＲ一１４１、ｍｉＲ－１４２．３ｐ、ｍｉＲ一１４２－５ｐ、ｍｉＲ一１４６ｂ、ｍｉＲ一 １４８ａ、ｍｉＲ．１５５、ｍｉＲ一１８ｌａ、ｍｉＲ—１８１ｂ、ｍｉＲ—１８８、ｍｉＲ－ １８９、ｍｉＲ一１９６ａ、ｍｉＲ—１９９ａ、ｍｉＲ．１９９ｂ、ｍｉＲ．２００ａ、ｍｉＲ一 ２００ｂ、ｍｉＲ一２００ｃ、ｍｉＲ－２０３、ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－２ｌＯ、ｍｉＲ－２１９、
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百度文库
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Ｎ：远端正常结肠组织；Ｔ：结肠癌组织
图２ Ｎｏｎｈｅｍ ｂｌｏｔ检测ｍｉＲ－２１在发生结肠癌时的变化
肠癌时表达量上升的ｐｒｅ—ｍｉＲＮＡ，即结肠癌组织（Ｔ）中 的量／远端正常结肠组织（Ｎ）中的量＞１．５的ｐｒｅ哪ｉＲ— ＮＡ。实验结果证明了ｐｒｅ．ｍｉＲＮＡ与成熟体１１１ｉＲＮＡ的 表达水平确实一致，这也更加充分地证明了所检测的 在发生结肠癌时上调或下调的那部分ｍｉＲＮＡ其变化 趋势准确无误。
ｓ锄ｐｌｅｓ．ＲｅｓＩｄｔｓ Ａｍｏｎ只ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２００ ｒｎｉＲＮＡｓ ｅｘａＩｌｌｉｎｅｄ，１３２ ｍｉＲＮ舳ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｅｘｐｒｅ８ｓｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃ蚰ｃｅｒ ａｎｄ ｎｏ册８１ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｉ８ｓｕｅ ｓ蛐ｐｌｅｓ，ａｎｄ ａｌｉｓｔ ｏｆ ９５ ｍｉＲＮＡｓ ｗ鹊８ｉｇ却ｉｆｉｃ肌ｄｙ ａｌｔｅｒｅｄ．Ａｍｏｒ培
用。结果检测６对结肠癌及其远端正常结肠的手术标本中ｍｉＲＮＡ的表达情况发现在结肠癌组
织／远端正常结肠组织中存在１３２种ｍｉＲＮＡ，并且有９５种ｍｉＲＮＡ在结肠癌发生过程中表达量发生
了显著的变化（变化倍数大于１．５），其中有４８种表达增加应用ＰＡＭ分析方法对９对结肠癌组织／
远端正常结肠组织进行了定性判断，发现预测结果与病理切片诊断结果一致。结论ｍｉＲＮＡ与结
ｍｅｓｅ ｍｉＲＮＡ８，４８ ｍｉＲＮＡｓ ｗｅｒｅ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ（ｆｏｌｄ ｃｈｒ唔ｅ＞１．５）．１ｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｌ一ｔｉｍｅ ｑＲＴ· ＰＣＲ ａｓｓａｖ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗａｓ ｖｅｒｉ６ｅｄ ｂｖ Ｎｏｒｔｈｅｍ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ蚰ｄ ａ ｔｈｅ瑚ｏｓｔａｂｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｒ培ｃｒｉｐｔａｓｅ ｂａＢｅｄ
近年来，研究结果显示ｍｉｃｒｏＲＮＡ在细胞生长和 发育过程中发挥重要作用，包括调控发育，分化，凋亡 和增殖等。ｍｉｃｒｏＲＮＡ是真核生物中一类长度约为２２ 个核苷酸的参与基因转录后水平调控的非编码小分子 ＲＮＡ，位于基因组非编码区，在进化上高度保守…。 成熟的ｍｉｃｍＲＮＡ是由较长的可折叠形成发夹结构的 前体转录物经过Ｄｉｃｅｒ酶加工而来¨引。
ｔｈｒｏｕ只ｈｐｕｔ ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ．ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｓｉ鼬ｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗ髓ａｄａｐ— ｔｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｉｆ矾Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｍｓ ｉｎ ６ ｐａｉ璐ｏｆ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｌｏｎ ｃ肌ｃｅｒ蚰ｄ ｎｏ肋ａｌ ａｄｊａｃｅｍ ｔｉｓ８ｕｅ
５．统计学分析方法：所有结果均以均数±标准差 （牙±ｓ）表示，数据用Ｓｔｕｄｅｎｔ—ｔ检验进行比较分析及 ＰＡＭ分析‘５１。
结果
１．成熟体ｍｉＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ：我们首先随机选取 了部分ｍｉＲＮＡ进行ＲＴ—ＰＣＲ，扩增循环分别是４０个和 ２８个，ＰＣＲ产物进行电泳后ＥＢ染色，紫外下观察并拍 照，凝胶电泳图如下（图１）。图中ｕ６ ＲＮＡ分子是一 种１００ ｎｔ大小的管家基因，作为内参。从结果看４０个 循环时远端正常结肠组织（Ｎ）和结肠癌组织（Ｔ）中各 个ｍｉＲＮＡ的ＰＣＲ均到达平台期，无法比较ｍｉＲＮＡ表 达量的多少，但可以看出ＰＣＲ产物单一，此实验方法 扩增ｍｉＲＮＡ结果很理想。我们用同样的实验方法探 知，在远端正常结肠组织／结肠癌组织中表达的ｍｉＲ一
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【Ａｂｓｔ均ｃｔ】 ｏｂｊｅｃ６ｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｂｅ珊ｍｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ０ｆ ｌｎｉＲＮＡｓ ｉｍｐＨｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃ锄ｃｅｒ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｕｎｃｏｖｅｒ ｔｈｅ ｃａｕｓａｔｉｖｅ ｒｏｌｅ８ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒ；ｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉ８．Ｍ：ｅｔｈｏｄｓ Ａ ｈｉｇｌｌ－
ｍｉＲ＿２２ｌ、ｍｉＲ一２２２、ｍｉＲ．２２３ ｍｉＲ．２２４。所有结果均以元 ±ｓ用柱状图表示，数据用ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ—ｔ检验进行比较分 析，表示８Ｐ＜Ｏ．０５，表示ｏＰ＜０．ｏｌ。
３．Ｎｏｒｔｈｅｍ ｂｌｏｔ：根据定量ＰＣＲ实验结果，我们随 机挑选了ｍｉＲ－２１，做Ｎｏｒｔｈｅｍ ｂｌｏｔ实验，证明ＩＩｌｉＲ－２１ 在发生结肠癌时上调（图２）。研究结果与ＲＴ－ＰＣＲ的 结果一致。
Ｎ：远端正常结肠组织；Ｔ：结肠癌组织；Ａ：发生结肠 癌时下降的ｍｉＲＮＡ；Ｂ：发生结肠癌时上升的ｍｉＲＮＡ 图ｌ 定量ＰＣＲ检测发生结肠癌时ＩｎｉＲＮＡ的变化情况
２．成熟体ｍｉＲＮＡ的定量ＰＣＲ：定量ＰＣＲ结果数 据处理方法为△△ｃＴ法，ｃＴ为反应达到域值时的循环 数，则每个ｍｉＲＮＡ相对于标准内参的表达量可以用方 程公式２一△ＣＴ表示，其中△ＣＴ＝ＣＴ ｍｉＲＮＡ—ＣＴ Ｕ６。 从定量ＰｃＲ的结果可知：在发生结肠癌时表达量上升 的ｍｉＲＮＡ，也就是结肠癌组织（Ｔ）中的量／远端正常结 肠组织（Ｎ）中的量＞１．５的ｍｉＲＮＡ有４８种：ｍｉＲ—ｌＯａ、
万方数据
·８９５·
１４３设计其反向互补序列作为Ｎｏｒｔｌｌ哪ｂｌｏｔ的探针（由
ｈｗｉｔｒｏｇｅｎ公司合成）。 ３．ｒｎｉＲＮＡ成熟体的逆转录·聚合酶链反应（ＲＢ
ＰＣＲ）：根据Ｃｈｅｎ等Ｍ ｏ所述，取１峭总ＲＮＡ进行逆转 录反应，反应步骤为１６℃孵育１５ ｒｎｉｎ，４２℃反应ｌ ｈ，８５ ℃孵育５ ｌＴｌｉｎ，得到的ｃＤＮＡ置于一２０℃保存。取１一 ｃＤＮＡ，２０一体系进行ＰＣＲ。ＰＣＲ的反应条件是：９５℃ １０ ＩＩｌｉｎ－＋９５℃１５ ｓ，６０℃ｌ Ｉｌｌｉｎ，４０循环。取ＰＣＲ产物 ｌＯ一在３％琼脂糖凝胶上电泳，并染色拍照。
４．ＩＩｌｉＲＮＡ成熟体及其前体的定量ＰＣＲ：ｍｉＲＮＡ成 熟体的定量ＰｃＲ技术的实验原理及实验步骤同ＲＴ— ＰＣＲ一样，在ＰＣＲ的时加入荧光染料ＥＶＡ ＧＲＥＥＮ。 仪器使用的是ＡＢＩ ７３００荧光定量ＰｃＲ仪，ＰｃＲ的反 应条件是：９５℃１０ ｍｉｎ一９５℃１５ ｓ，６０℃１ ｍｉｎ，４０ 循环。№ｎｈｅｍ ｂｌｏｔ配含尿素的１５％变性聚丙烯酰胺 凝胶，电泳缓冲液为０．５×ＴＢＥ；取３０斗ｇ总ＲＮＡ样品 与等体积的甲酰胺ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕ虢ｒ混合，９５℃保温２ ｍｉｎ，冰上骤冷，上样，１５０ Ｖ电泳直至溴酚蓝移到胶底 部，切下溴酚蓝和二甲苯青之间的部分；半干转膜仪中 将滤纸、尼龙膜与胶按顺序铺好，３００ ｍＡ转膜ｌ ｈ；转膜 结束后将膜置于２×ＳＳｃ漂洗，吸干，之后紫外交联； 将膜放到杂交管中，加预杂交液，杂交炉中３７℃反应 ３０ ｍｉｎ；弃预杂交液，加入杂交液及标记好的探针，３７ ℃旋转杂交过夜；杂交结束后，反复洗几次膜，吸干，磷 屏扫描。探针的标记方法为：混合１“１１０ ｐｍｏＬ／斗ｌ探 针，２仙１１０×Ｔ４ＰＮＫ Ｂｕｆｆｅｒ，２灿ｌ Ｔ４ＰＮＫ（Ｔ４多核苷酸 激酶），５灿ｌ ＲＮａｓｅ．ｆｒｅｅ水以及１０斗ｌ比活度为 ５０００ ｃ∥ｍｍｏｌ比浓度为ｌＯ斗Ｃ∥“ｌ的［ｒ一３２Ｐ］Ａ１Ｐ，３７℃ 反应４５ ｍｉｎ，然后６５℃保温１５ ｌｌｌｉｎ使酶失活。内参设 为５ ｓ ｒＲＮＡ条带。
ｓ锄ｐｌｅｓ Ｉｌｉ出 ｃａｎｃｅｒ
ｂｌｉｎｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｃｌｉｌｌｉｃａｌ ａｎｎｏｔ砒ｉｏＩｌｓ．ｃｏｎｃＩｌＩｓｉｏⅡＴａｋｅｎ ｔｏ窘ｅｔｈｅｒ，ｔｌｌｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｍｄｙ
ｌｉｇｈｔｓ ａ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎ∞ｉ８． 【Ｋｅｙ ｗｏｒ凼】 ＩＩｌｉＲＮＡ： Ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏ眦：’ｒｕｍｏｒ ｍ盯ｋｅｒ
４．ｍｉＲＮＡ前体的定量ＰＣＲ：一般情况下，ｍｉＲＮＡ 前体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）的表达水平与成熟体ｍｉＲＮＡ的表 达水平是一致的，也就是说，有高的成熟体ｍｉＲＮＡ，必 然对应高的ｐｒｅ—ｍｉＲＮＡ，所以，我们随机选择了部分 ｍｉＲＮＡ对其前体进行了定量ＰｃＲ。图３为在发生结
万方数据
·８９６·
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Ｎ：远端正常结肠组织；Ｔ：结肠癌组织上升的ｐｍ一面ＲＮＡ 图３ 定量ＰｃＲ检测发生结肠癌时ｐ咒－ｍｉＲＮＡ的变化情况
·８９４·
·实验研究·
ｍｉｃｒｏＲＮＡ在结肠癌组织的表达及其 临床意义
于振涛蔡星 尚晓滨殷媛张燕张辰宇
【摘要】 目的探讨结肠癌组织与对应正常结肠组织ｍｉＲＮＡ表达特征及其在结肠癌的诊断
中的意义。方法通过定量聚合酶链反应（ｑＲＴ．ＰＣＲ）法检测了６对结肠癌及其远端正常结肠的手
术标本中２００种ｍｉＲＮＡ的表达情况，并应用ＰＡＭ分析法探讨“ＲＮＡ在预测结肠癌病变中的作
标本在研钵中充分研碎，用嘣ｚｏｌ提取总ＲＮＡ。紫外
分光光度计检测纯度，测总ＲＮＡ的Ａ：蚴。为１．８—
２．Ｏ。
２．引物及探针的合成：根据Ｃｈｅｎ等Ｈ１所述成熟 体ｍｉＲＮＡ的茎环ＰｃＲ法设计近２００种ｍｉＲＮＡ的ＰｃＲ 引物（由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成）。根据Ｓｃｈｍｉｎｇｅｎ等［５】 所述ｍｉＲＮＡ前体的ＰＣＲ法挑选部分ｐｒｅ—ｍｉＲＮＡ设计 其ＰＣＲ引物（由ＳＢｓ公司合成）。选取ｌｎｉＲ－２ｌ，ｎｌｉＲ．
ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ｑＲＴ—ＰＣＲ晒ｓａｙ．Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｕｔｉｂｔｙ ０ｆ ｍｉＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗ鹪ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＰＡＭ ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ，ｗｈｉｃｈ ａｐｐｌｉｅｄ ａ ｍｏｄｅｓｔ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｌｌｌｉＲＮＡｓ硒Ｐｍｍｉｓｉｎｇ出ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅ瑙ｆｏｒ ｃ０１０ｎ
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０７７２４８４） 作者单位：３０００６０天津医科大学附属肿瘤医院食管肿瘤科（于振 涛、尚晓滨）；南京大学生命科学院医药生物技术国家重点实验室（－蔡 星、殷媛、张燕、张辰宇） 通讯作者：张辰宇
材料和方法
１．标本与ＲＮＡ提取：收集天津市肿瘤医院２００４ 年至２００７年之间手术切除的１５例结肠癌组织标本和 与之对应的远端切端正常结肠组织标本。所有标本都 是液氮冻存，临床病理资料齐全。低温环境下把上述
ＮＡ共有１３２种。此外，当循环数合适ＩｎｉＲＮＡ正好处 于指数增长期时，如２８个循环时，也可以直接通过 ＲＴ—ＰｃＲ的方法观察到ｍｉＲＮＡ在远端正常结肠组织 （Ｎ）和结肠癌组织（Ｔ）中的表达有差异，在发生癌症 时ｍｉＲ＿２０与ｍｉＲ一１４ｌ呈上升趋势，ｍｉＲ－１２５８、ｍｉＲ—１４５ 和ｍｉＲ—１９５呈下降趋势。