实验2 蛋白质的分离纯化

以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离
纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。 3、纯化检测仪器连接：
将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒流泵 (10rpm)
（流速0.2～0.6 ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速： 0.5mm/min，50mV）、部分收集器（3～4 ml/管）等按下图连接并设置好。
3.5－二硝基水杨酸试剂
蒸馏水 观察颜色
0.5ml
5ml
0.5ml
5ml
100℃水浴5min
收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存备用，
六、结果分析讨论
下次实验内容
用正交法测定蔗糖酶活性的最适反应条件
自主实验设计与实践——立题指导，准备填写 《自主实验设计与实践课题申请书》
Fast Flow凝胶；待凝胶自然沉积30 min 后松开层析柱出口，调节流速 1ml/3min；
Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液
连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。 5、加样： 用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意样品顺 着柱壁加入，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体。待样 品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，
停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，
并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度，继续用20 mmol/L Tris-HCl、
pH7.3的缓冲液洗脱。
6、洗脱（梯度洗脱法）：
待未吸附的杂蛋白洗脱完全后（此时层析柱流出液在核酸 蛋白检测仪上绘出的基线稳定），改用梯度为0-1mol/L NaCl 的 梯度缓冲液进行洗脱。层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为 50ml 0.02mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的 洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖 酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），
实验操作方法和步骤
1、离子交换剂准备：(实验室已准备好）
DEAE-Sepharose Fast Flow ， 取适量DEAE-Sepharose Fast Flow ，加入0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl溶液，轻轻搅拌， 浸泡0.5小时，用布氏漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽 干后，放入小烧杯中，加 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，
纯化检测仪器连接示意图
部分收集器 层析柱（φ1.0×20㎝ ）
2
1
DEAE- Sepharose Fast Flow
梯度混合器
恒流泵
核酸蛋白检测仪 记录仪
1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液
2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子
＋
可逆交换
阳离子交换剂
基质
—
电荷基团
＋ 反离子
＋
溶液中的离子 或离子化合物
可逆交换
阴离子交换剂
基质
＋ 电荷基团
—
—
—
溶液中的离子 或离子化合物
反离子
2、酶活性检测 蔗糖酶（β -D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26）， 是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键 裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol 蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采 用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原 糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的 量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样 品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多 少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
实验二 蛋白质的分离纯化
离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂 为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液 中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助 离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进 行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当 洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质 的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所 带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡 ：
装柱前将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L TrisHCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀 （注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续 加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待柱内DEAE-Sepharose Fast Flow 凝胶沉降并分出水层后，吸去水层，再补加处理好的DEAE-Sepharose 直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE-
0.02ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。洗脱流速不变，每3-4ml接一管，
并留样用于后续实验 ，样品－20℃低温保存备用。
7、蔗糖酶活力检测
空白对照 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 5%蔗糖溶液 分离纯化样品溶液 0.5ml 0.5ml / 样品管 0.5ml 0.5ml 0.02ml 50℃水浴5min
同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE-
Sepharose
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Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L TrisHCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。
2、样品处理：
将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3
缓冲液；4℃ 12000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体 积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定