诱导多功能干细胞问题的研究进展

诱导多功能干细胞问题的研究进展

基科33 阮志远2013012342

前言：干细胞是一类具有自我更新能力、多向分化潜能的未分化成熟的细胞[1]。干细胞的这两个特性使得其在临床上有广泛的应用前景。研究表明，胚胎干细胞在治疗脊髓损伤、糖尿病、镰刀形贫血症等一系列疾病有重要的应用价值。然而，由于胚胎干细胞移植存在技术、伦理、免疫排斥等诸多限制，有关胚胎干细胞的研究及应用受到较大管制。因此，寻找一类与胚胎干细胞具有类似功能的细胞成了干细胞领域的一个重要研究方向。科学家们经过长期的研究发现，通过特定条件可以将成熟体细胞逆分化成具有再分化潜能的干细胞，即诱导多功能干细胞（IPSCs）.毫无疑问，这项技术的实现使得干细胞医学应用焕发了新气象。下面就IPCS技术的最新发展及应用进行综述。

1.IPSCs的研究背景

研究表明，胚胎干细胞在细胞替代，组织修复，器官再生，基因治疗等多个方面有广泛的应用，但由于胚胎干细胞的的研究存有诸多限制，研究者们把目光聚集在了能否实现细胞逆转而使细胞具有干细胞的某些特性。自1952年Briggs和King率先成功培育出囊胚细胞核与去核卵母细胞融合而成的克隆胚胎以来，经过半个多世纪的探索，科学家们已经充分证明已分化的细胞的可逆转性。然而，传统的体细胞重编程技术，如体细胞核移植存在着效率低下及不可避免的伦理问题，寻找新型的技术对于研究者们而言势在必行。随后，一种以转化因子直接对细胞核的重编程（通过这种方法获得的干细胞即为IPSCs）开始进入研究者们的视野并逐渐成为研究热点。

2. IPSCs的研究进展

2.1. IPSCs的研究过程（以Yamanaka的工作为例）[2]

首先，通过筛选，Yamanaka小组将目光投向24种特异性基因，并进行相应的检测。接着，Yamanaka小组设计了在小鼠Fbx15基因处插入一段βgeo基因卡带

（该基因的表达能对G418产生抗性），而Fbx15在胚胎干细胞当中才能表达的特

性使得只有成功诱导的细胞才能G418(一种新霉素类似物)的培养基具备抗性，未

诱导成功的体细胞因无法再G418培养基上生存从而被淘汰。然后，按照这种筛选方式，Yamanaka小组将24种候选因子通过逆转录病毒转入小鼠的MEF上并进行

检测。通过依次剔除一个候选因子来检测剩余因子能否继续维持细胞抗性来确定该因子是否为诱导必需因子的方法，最终，Yamanaka小组确定了诱导MEF重编程的“必需转化因子”组合，即Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc。紧接着，Yamanaka小

组对G418培养基上的抗性细胞群进行干细胞特性的验证。他们利用了RT-PCR、

染色质免疫共沉淀技术、端粒酶活性测定、DNA芯片、诱导畸胎瘤形成等多种方

法发现[3]，IPSCs在细胞外型和生长特征上面与ESC非常相似，基因表达谱也高

度类似，除了少量基因表达的差异。和ESC相同，IPSCs一样也具有分化成早期

胚胎三个胚层的能力，也能产生嵌合体小鼠并产生生殖细胞。同时，两者在基因组水平的甲基化程度也是相同的。至此，IPSCs正式诞生。

2.2.IPSCs的最新发展：

近几年来，关于IPSCs的研究呈现出蓬勃生长的发展趋势，各类相关研究接踵而至，更有甚者取得了突破性的进展[1]。

①物种选择：由最初Yamanaka所做的小鼠和人的基础之上，研究者们又做了关于

猪、恒河猴、大鼠的IPCSs，不过很多还未形成嵌合体。

②细胞种类：被用于重编程的研究的供体细胞有成纤维细胞、肾上腺细胞、肌细胞、

造血系细胞、肠上皮细胞等。由此可见，用于诱导形成IPSCs的细胞种类繁多。但最近日本东北大学教授出泽真理提出，只有皮肤细胞内的特定细胞才可发育为IPS细

胞。他的研究小组发现，如果只提取“Muse细胞”（存在于人体皮肤的纤维母细胞中）将其置于IPCSs培养基上，能获得比传统方法更多的IPCSs细胞，但如果使用纤维母细胞中的其他细胞，却完全没有得到IPCSs细胞。基于这个实验事实，他们假设能够成为IPCSs的供体细胞可能就是存在于特定皮肤组织中的一种干细胞，也就是他们宣称的新型干细胞“Muse”细胞。

③因子导入途径：基因导入的方式按照转入因子是否与宿主基因整合重组大致可以分为两种：整合型与非整合型[4]。早期使用的包括逆转录病毒、慢病毒在内的一系列病毒载体将外源基因序列随机整合到基因组中，存在诱发肿瘤和宿主细胞基因表达异常的风险。虽然后来有科学家使用转座子技术[5]（该序列在接入转化因子以后形成重组转位子插入细胞染色体以后通过转位子酶的瞬时表达而将先前导入基因切除）可以有效避免载体本身的基因对宿主基因的侵染，但依旧无法解决整合对宿主细胞带来不可控的影响。随后，各国科学家们陆续报道了非整合型载体介导的方法，如微环、附加体、质粒和蛋白质[6]等（非整合型载体的成功诱导表明外源基因只是重编程的启动因子，无需持续组成性表达）。

④转化因子种类优化：最初，Yamanaka将四种转化因子，即Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc导入到细胞中。后来，科学家们发现，c-Myc存在潜在的致癌作用，为了解决这一问题，Nakagawa小组和Wernig小组仅用Oct3/4、Klf4、Sox2三种基因作为诱导因子并成功诱导鼠和人成纤维细胞为IPCSs。之后科学家们又证实了仅用Oct3/4足以将神经干细胞重编程为IPCSs。研究人员发现，这些诱导因子对于调控细胞周期和细胞命运方面有着重大影响，因而从这个视角出发人们又发现了一系列新型的转化因子：如Lin28和miRNA[7]。

⑤诱导效率的提高：由于诱导过程中涉及了大量的信号调控网络，因此为了能够提高诱导效率，在诱导过程中尽量避开抑制细胞增殖而走向分化或者凋亡的通路（如抑癌基因p53及其引发的一系列下游通路、TGF-β通路），并寻找促使细胞向IPCSs过渡的

信号通路（如影响体轴发育和形态发生的Wnt通路以及细胞极性发育的Hedgehog通路）是非常有必要的。而最近报道科学家们通过阻断p53信号通路可将IPSCs的转化率提高百倍[8]的实验事实更是对这一说法的肯定。研究人员通过实验发现Lin28在调控信号通路方面，有着极大的作用。一方面，Lin28通过与类let-7家族的miRNA的前体发生反应，抑制了类let-7对Wnt/Hedgehog通路的调控作用，使得这两个通路发生异常而产生相反的效果——作为细胞增殖的动力影响IPCSs内增殖；另一方面，Lin28可以抑制p53的表达，从而解开细胞中对于增殖的抑制作用。除此之外，研究人员还发现维生素C能够阻断BMP信号通路[9]（H3K9的甲基化使得Oct3/4结合位点受到抑制）使得IPCSs前体转化成IPCSs，Wnt3a能够增强Wnt信号通路从而提高诱导效率。

3.IPCSs技术研究面临的挑战

IPCSs仍需克服的困难主要集中在三个方面：低效性、致癌性、细胞多能性。传统的IPCSs技术采用整合病毒的方式导入因子，然而，这两种病毒自身的基因在转入过程中也有可能与宿主细胞发生整合导致宿主细胞的染色体重组、DNA突变而使某些基因异常表达或者不能表达。一些致癌基因的插入可能会导致宿主细胞上的原癌基因被激活从而使整合细胞朝着肿瘤细胞方向发展。而非整合导入形式虽然减少了致癌的风险，但是诱导效率却大幅度下降。虽然也有直接转入经转化因子修饰过的mRNA的方式，其诱导效率相对较高，但是mRNA的修饰技术难度较高且实验工序复杂，难以推广应用。另外，也有研究人员指出，诱导多动能干细胞的分化发育能力低于胚胎干细胞，IPSCs细胞不能完全表达胚胎干细胞的生物学特性。由此看出，进一步研究重编程的作用机制，了解IPCSs再分化过程中的基因表达依旧是一个重要课题。

4. IPCSs技术的应用前景

IPSCs摆脱了体外核移植和细胞融合的技术难度束缚，打开了长期以来胚胎干细胞技术应用的伦理禁锢，选择了一条以特定转化因子组合的诱导来实现干细胞的再生，从而开创了医学和生物学领域的新时代。IPSCs以其独有的细胞特性而被多个领域重视，比如肿瘤研究、疾病模型、药物测试、再生医学等。

肿瘤研究[10]：IPSCs技术的发展为人类肿瘤研究与治疗开启了新思路：基础研究方面，IPSCs细胞技术为研究人肿瘤细胞重编程提供了强有力的体外研究体系，此类研究对于解释肿瘤发生机制无疑具有重大意义；临床治疗方面，笔者认为，如果能将肿瘤细胞逆转化为IPCSs细胞，同时又保持肿瘤细胞的不断增长特性用以修复被肿瘤所破坏的组织，那么肿瘤治疗将向前迈了一大步。

遗传性疾病治疗：利用基因打靶技术将患者的成纤维细胞纠正基因错乱之后重编程IPCSs细胞，接着将其诱导分化成表现正常的髓细胞和造血干细胞，从而用来进行个性化疾病治疗。

疾病模型[11]：在IPSCs细胞的诞生之前，再生医学的研究者们主要是利用在体外建立疾病特异的胚胎干细胞群[12]。但是由于这种方法只能通过早期诊断筛查的办法得到一些常见的单基因突变的ESC，而且利用胚胎进行疾病机制研究有极大的伦理问题因而受到严格的管制，无法进行广泛应用。无疑IPSCs的诞生给疾病模型的建立提供一个便利的途径：通过分离患者身上的皮肤细胞并诱导成IPSCs，从而建立起相应的疾病模型来进行疾病作用机制和药物测试等多方面问题的研究。目前，科学家们已经成功建立了多种具有明确遗传背景的IPSCs疾病模型。

药物测试：目前药物测试主要通过实验动物或癌细胞系进行检测，但毕竟动物的病理及药物疗效相较于人而言还是有较大的差别，因此人IPSCs细胞及其在体外定向分化的功能细胞显然为药物在细胞水平上的测试提供了更理想的模型。