16 组织工程

成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）：是不含糖的分子量为16KD的单链 多肽，因能促进成纤维细胞生长而得名。由于对 血管也有较强的促进作用，又称为血管生长因子 。可以诱导血管化、骨形成并促进神经再生。
表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF） ：是由53个氨基酸组成的单链多肽。是表皮细胞 和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。能促进伤 口愈合，在体外可以刺激角化细胞分裂，在体内 促进上皮的再生。
John Homans Professor of Surgery at Harvard Medical School
Robert Langer
Professor of Chemical and Biomedical Engineering at MIT
2. 组织工程三要素
1.种子细胞 2.支架材料 3.影响因子
此外材料要及时降解，让位给 成长的有髓神经。
（三）生物人工肝
生物人工肝（Bioartificial liver）由肝 细胞、专用反应器和体外循环系统三 大部分组成，是将患者的血桨在体外 循环代谢的一种辅助装置。 由许多空心的纤维毛细管集束组成， 肝细胞在毛细管外空间培养或者粘附 在微载体上培养，患者血桨通过泵循 环进入毛细管，这样肝细胞和血桨间 分子可以自由交换，肝细胞吸收氧和 营养物，脱除血桨中的有害、有毒物 质，并将肝细胞代谢物质传输至血桨 内输送回体内。 提供肝细胞生长因子等生长因子在体 外维持正常功能。
张应力（Tensile stress）： 体内有心脏搏动， 肌肉收缩等张应力。可采用弹性泡沫或纺织网等 载体材料模拟体内的张应力。
2. 细胞生长因子
细胞生长因子（Cell growth factor）主要是指在细胞间传 递信息、对细胞生长具有调节功能的一些多肽。 转移生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGFβ）： 一种分泌型的多功能蛋白，可以调节细胞增殖、分 化与细胞外基质分泌，参与炎症和组织的修复。 骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP) ： 1965年于脱矿化骨的骨基质中发现的，因其能诱导骨、软骨 形成而得名。
（一）种子细胞
1.定义 种子细胞(Seed cell)：是组织修复或再生的细胞材料。 2.来源
（1）干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞。
（2）功能细胞：组织来源的体细胞。 3.特点 容易获得和体外培养、遗传稳定。 4.问题 （1）同种、异种细胞存在免疫排斥等问题。
（2）干细胞潜在的理想种子细胞，诱导分化技术有待完善。
B多糖类
壳聚糖（Chitosan）
甲壳质的基本单位是乙酰葡萄糖胺，它是由1000～3000 个乙酰葡萄糖胺残基通过p1，4糖甙链相互连接而成聚合 物，是节肢动物角质内的主要结构多糖。 壳聚糖是甲壳质的部分脱乙酰化产物，具有阳离子性 质，因此可以吸引糖胺聚糖、蛋白聚糖等带负电荷的大 分子聚集在支架内，即利于收集组织液中的生长因子。
（2）流体应力生物反应器
模拟人体血管应力环境而设计的用于体外构建组织工程 化血管的装置。
主要由可以通过循环液体的硅胶管、压力传感器、蠕动 泵、储液罐、电磁阀等组成。可通过形成有波动的液流 并能控制流量来模拟体内血管的应力环境。
16.4
组织工程应用
1. 组织工程皮肤
中国每年烧伤、溃疡等皮 肤疾病1500万人，需要 皮肤移植的约350万，需 4亿立方厘米。
（3）构建成纤维细胞-PGA复合物 酶法消化收集真皮成纤维细胞，接种在PGA上， 加入培养液培养。 （4）接种表皮角质形成细胞在前面的复合物 上，更换表皮角质形成细胞培养基培养5天左右。
（5）双层皮肤成熟
将复合物放在可渗透膜上，进行气-液界面培养， 促进表皮角质形成细胞的进一步分化。
再培养1周，形成含真皮和表皮两层结构的组织 工程化皮肤。
凝胶法：将高密度细胞悬浮液与多种物质如胶原、藻酸纳、几丁 质等按照一定工艺复合形成凝胶，细胞均匀地分布于凝胶内。
吸附法：将已预湿的支架材料置于培养皿中细胞悬液中或用滴管 将细胞液滴加在材料上，然后利用负压使细胞吸附在材料上。
（二）细胞因子的控制释放
1.在支架材料构建时使细胞因子结合在支架材料 内部，并能缓慢释放。 2.包埋或者微囊化是目前控制细胞生长因子释放 的一个重要方法
16.2 组织工程技术路线
（1 ）
种子细胞
（2 ）
原位修复 移植 替换
（3 ）
支架材料
信号分子、生长因子
组织器官 再生
（一）细胞接种
浸渍法：将经预湿处理材料置于细胞悬浮液中实现细胞接种。 沉淀法：将细胞液缓慢逐滴滴加到已经预湿的支架材料上，放置 培养箱中2-4小时，待细胞充分粘附后缓慢加入培养液培养。
（3）复合材料
复合材料：由两种或两种以上不同物理化学性质的材 料复合而成的新材料，一般由基体材料和增强材料组 成。 包括无机材料、有机材料、天然材料与合成材料间的 组合。
例如：羟基磷灰石-甲壳素、羟基磷灰石-PLA、聚乳酸 （Polylactic acid,PLA）-聚羟基乙酸（Polyglycolic acid,PGA）：PLGA等。
生长因子研究与制备 ——骨形态发生蛋白（ BMPs）
1965年美国首先从骨基质中分离出骨形态发生蛋 白，经过25年才得以纯化。随后克隆了相关基因。
原位状态下以ng/g骨基质剂量释放足以促发骨修复， 人工基质需要mg/g剂量才能促发骨修复，因此成本 非常高。
利用转基因技术将BMP基因转染到骨髓细胞中，再 将其种植在矿化基质上，达到骨修复的目的。
2）合成高分子材料
聚乳酸（Polylacticacid，PLA）
聚羟基乙酸 （Polyglycolicacid，PGA）
聚羟基丁酸（Polyhydroxybutyrate,PHB）等。
（2）无机材料
氧化铝陶瓷、碳纤维、生物陶瓷、羟基磷灰石、合金 等，主要用于人工骨、人工肌腱、人工关节等。 例如：钴、钛、钢铁基合金金属材料组成人工髋关节的 股骨头、膝关节的股骨髁的表面，超高分子聚乙烯材料 组成人工髋关节的髋臼股份、人工膝关节的胫骨平台部 分，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥用于人工关节假体与骨组 织的固定。
难题 ： 1.血管化：血管生成是指内皮细胞构筑的毛细血 管分支和伸展。血管生成有助于损伤组织的修复。
2.毛囊、汗腺等再生。所以美容慎用。
3.排异性。 我国人造皮肤2007年第四军医大学开发成功，进 入临床阶段。
二 神经修复工程
神经远端轴突和髓鞘崩溃时，大量吞噬细胞 侵入，一方面清除轴突髓鞘的碎屑，另一方 面刺激原来处于休眠状态的雪旺细胞 (Schwann cell．SC)分裂和增生，并沿着每 一根神经纤维的神经内膜和基底膜排列成柱 状，形成一个潜在的管道（即Buengner氏细 胞带）；再生轴突通过Buengner氏细胞带， 伸延到终末器官，恢复其功能。最后产生髓 鞘，形成为有髓神经纤维。 （一）种子细胞
16.3 组织工程生物反应器
1.微重力旋转式生物反应器 （1）转壁式生物反应器：一般由两个 内外同心圆柱组成。内柱由半透膜构成 ，气体可通过膜交换。内外柱之间充以 连续灌注的培养介质。将细胞与培养液 置入内、外圆柱体。整个装置可以绕内 轴旋转，离心力与重力平衡，为细胞生 长提供一个微重力环境。 普通培养条件下只能呈二维贴壁生长的 哺乳动物细胞表现出三维增殖与分化形 成有功能的组织块。
1.定义 组织工程支架材料是 指替代细胞外基质使 用的生物医学材料材 料。
纤维支架材料
细胞外基质 (extracellular matrixc, ECM )
（1）定义：动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细 胞表面或细胞之间的大分子。
（2）分布：结缔组织中ECM含量较高。 （3）组成：构成细胞外基质的大分子包括：胶原、 非胶原糖蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖四大 类。 （4）功能： 1）ECMs提供细胞所需的力学和化学信息，是细胞发 挥功能的环境；对细胞群体有支持、保护的作用。 2）ECMs对细胞形态、迁移、增殖、分化有调节作用 。
（3）多种类型细胞协调增殖、分化。
以骨为例
1-细胞 成骨细胞：合成ECMs、矿物质、 胶原，组装成新骨 破骨细胞：分泌酶使ECMs、矿物 质、胶原被吸收
软骨细胞：合成ECMs构成软骨 干细胞 2-支架
羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH，HA]、 胶原纤维
3-生长因子 骨形态发生蛋白
（二）支架材料
2.特点
（1）生物相容性：生物医学材料引起宿主反应 和产生有效作用的能力。
（2）生物降解性：材料完成支架的作用后能被 降解，降解速率与细胞生长速率相互协调。 （3）合适的三维立体结构。 （4）加工性与一定的机械强度。 （5）良好的消毒性能。
3.分类
有机材料与无机材料、天然材料和人工合成材料 、单一材料和复合材料。
雪旺细胞(Schwann cell．SC)：SC形成能引 导再生轴突生长的Buengner氏细胞带，并能 分泌多种细胞因子调控再生轴突生长。
（二）支架材料
目前比较常用的生物材料是聚 羟基乙酸(polyglyeolic acid．PGA)和聚乳酸 (polylactic acid．PLA)。
制成直线的丝状有利于SC排列 成线状，为形成Buengner氏细 胞带制造有利条件。
透明质酸（Hyaluronic acid,HA） 透明质酸是由N-已酰氨基 葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的 重复结构组成的线形多糖 结构。 在结缔组织中比较丰富。 透明质酸可高度水化，对 组织的水分平衡和关节的 润滑有重要作用，已经在 整形外科中被广泛采用。 保护及润滑细胞，在化妆 品、美容行业广泛使用。
人工表皮、复合人工皮 A 表皮 B 表皮网状 棘 C 真皮乳头 D 真皮
E 皮下组织
F 毛发
组织工程皮肤技术路线
构建步骤
（1）种子细胞与培养液 成纤维细胞：DMEM培养基、10%胎牛血清、青 霉素、链霉素等。 表皮角质形成细胞：DMEM+Ham F-12培养基、 表皮生长因子等。 （2）支架材料 聚羟基乙酸（PGA）。
神经生长因子 (Nerve growth factor,NGF) 为神经细胞特 异性分泌的营养蛋白，是具有营养、保护神经元及促进 突起生长等生物学功能的神经细胞调节因子。对中枢及 周围神经元的发育、分化、生长、修复、再生和功能特 性均有重要的调控作用。 肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF） 因 最初被发现可剌激肝细胞合成DNA而得名，是由728个氨 基酸残基组成的多肽单链。肝细胞生长因子是目前已知 生物活性最广泛的生长因子之一，能刺激多种上皮和内 皮细胞进行有丝分裂、运动，能促进肾小管形态发生， 在肾脏的发育、再生中具有较强的作用。
第16章 组织工程
本章主要内容
1.组织工程及其三要素
2.组织工程技术路线 3.组织工程反应器 4.组织工程产品 本节主要问题 种子细胞、组织工程材料、影响因子
16.1
组织工程及其三要素
1. 定义
组织工程(Tissue Engineering) ：是利用生命科 学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利 用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官 再生的一门技术。 20世纪80年代提出概念。 Joseph P. Vacanti
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）
（三）影响因子
细胞对Βιβλιοθήκη Baidu部环境产生的应答是通过感知某种化学信号或 物理刺激，并将之传递到细胞核中，促发或者抑制基因 的表达实现的。细胞的增殖与分化由各种因子调节。
1.物理因子 主要是应力的作用： 流体切应力（Flow shear stress）：由血流对血 管壁施加的力。体外可采用常流和脉动流循环装 置调节切应力大小。
（1）有机材料
1）天然高分子材料
胶原、壳聚糖、透明质酸等。
A蛋白类
胶原（Collagen） 胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白, 是 构成细胞外基质的骨架，是胞外基质重要的 结构蛋白。 根据组成的氨基酸与聚合度不同有10种。具 有高度缠绕的螺旋结构的纤丝，由纤丝与其 他基质分子相互作用达到组织需要的强度、 弹性。 成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细 胞等合成或分泌，分布于各个部位。