羟脯氨酸

一种新型优化的肝组织羟脯氨酸含量测定方法的建立

修贺明郭争荣徐铮

【摘要】目的：建立一种可信度、敏感度高，适合于微量组织羟脯氨酸含量的测定方法―胃酶酸解法。方法：在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对胃酶法和传统盐酸水解法进行了比较。结果：在相同条件下，传统方法测得HYP含量为0.045ug/ml－1.547ug/ml，平均0.7789ug/ml；胃酶酸解法测得羟脯氨酸含量为

2.955ug/ml－4.500ug/ml，平均为

3.921ug/ml，两者比较有显著性差异（P＜0.01）。结论：胃酶酸解法的可信度、敏感度均优于传统方法，其更适合于微量组织羟脯氨酸的测定。

关键词：羟脯氨酸胃酶酸解法

【abstract】objective：

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成份之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，被认为是胶原中的特征性氨基酸。因此，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标，寻求一种合理、优化的HYP含量的测定方法已成为众多学者关注的焦点。

目前，人们对传统的HYP含量的测定方法－盐酸水解法已达成了共识，但是传统方法对组织要求量比较大，水解不够彻底等缺点限制了其广泛应用。近年来大批的学者对HYP的测定条件进行了多方面、多层次、多途径的研究，同时也深入的探讨了不同测定方法，虽然在时间、试剂用量、所需器材等方面有了很大的改进，但对其测定方法的研究欠少，仍未能找到一种方便、快捷、可靠性高的测定方法。笔者对HYP含量测定方法进行了仔细的研究，针对传统方法的缺点对传统方法进行了改进，在组织、重量、氧化时间、显色温度、样品中盐浓度及对二氨基苯甲醛（PDAB）一定的条件下，对两种方法进行了比较，探索出一条更为先进、更为稳定可靠的HYP 检测方法。现报道如下：

一，材料及其方法

1，主要实验材料

1.1 羟脯氨酸标准品北京鼎国生物技术发展中心

1.2 酶标仪美国VERSAmax

1.3 微量电子天平瑞士METTLer AE260

1.4 对二氨基苯甲醛天津市博迪化工有限公司

1.5 氯胺－T 天津市精细化工研究所

2，试剂配制

2.1 标准HYP储存液（1mg/ml）：称取100mgHYP标准品，用0.1mol/l盐酸溶解并定容至100ml，

置棕色瓶于4℃保存。

2.2 标准HYP应用液（25ug/ml）：取标准HYP储存液（1mg/ml）2.5ml，双蒸水定容至100ml，4℃保存，可用2－3周。

2.4 0.1mol/l 柠檬酸缓冲液（PH=6.0）：0.3g柠檬酸和

3.25g柠檬酸钠加双蒸水溶解并定容至100ml。

2.4 0.05mol/l氯胺－T溶液：1.41g氯胺－T用少量甲醇溶解并定容至100ml。

2.5 10％对二氨基苯甲醛（PDAB）：10gPDAB用少量甲醇溶解并定容至100ml。

2.6

3.15mol/l高氯酸溶液：70％高氯酸27ml加蒸水至100ml。

2.7 40％NaOH溶液：40gNaOH双蒸水溶解并定容至100ml。

2.8 0.5％胃蛋白酶溶液：0.5g胃蛋白酶加少量0.2mol/l盐酸溶解并定容至100ml。

3，组织样品

本实验组织样品为肝硬化大鼠肝组织（Wistar大鼠由河北医科大学动物实验中心提供），肝硬化模型用0.03％硫代乙酰胺（TAA）喂饲5月制备[1]，经病理检查证实为肝硬化后用25％硫奔妥钠腹腔麻醉后开腹摘取肝右叶，－80℃保存备用。

4，标准曲线的制备

（1）500ul去离子水作为空白对照，然后500ul标准羟脯氨酸溶液（25ug/ml）做倍比稀释，浓度依次为25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.13ug/ml，1.56ug/ml，0.78ug/ml。

（2）依次加入0.1mol/l的柠檬酸缓冲液（PH6.0）和0.05mol/l氯胺－T溶液，37℃水裕氧化25分钟。

（3）3.15mol/l高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5分钟终止氧化。

（4）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3分钟（显色）。

（5）冰裕冷却，空白凋零，酶标仪测定A560nm

传统方法肝组织羟脯氨酸的测定

（1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。

（2）加入3ml 6mol/l盐酸，混匀，移入15ml的试管，120℃高压水解2小时。

（3）40％的NaOH调PH值到6.0，然后12000转离心15分钟。

（4）取500ul上清加入一新准备的15ml试管中，依次加入0.1mol/l的柠檬酸缓冲液（PH6.0）和0.05mol/l氯胺－T溶液，37℃水裕氧化25分钟。

（5）3.15mol/l高氯酸溶液1ml，混匀，室温作用5分钟终止氧化。

（6）10％的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3分钟（显色）。

（7）冰裕冷却，空白凋零，和准备的标准品一起测定A560nm.

胃酶酸解法肝组织羟脯氨酸的测定

（1）微量天平称取肝组织50mg，匀浆器匀浆。

（2）加入3ml 0.5％胃蛋白酶溶液，混匀，移入15ml的试管，37℃保温24小时，每隔3－5小时混匀一次，使其充分水解。

（3）加入1ml 6mol/l盐酸，120℃高压水解2小时。

（4）以下步骤同传统方法3－7。

二，结果

1，组织匀浆传统盐酸水解方法在组织匀浆静置1小时后液体出现分离状，沉淀较多；而胃酶酸解法静置后仍呈混悬状态，几乎看不到沉淀.由此可见，胃酶酸解法能够充分水解组织中的胶原，比传统方法水解更加彻底。

2，标准曲线标准曲线如图1 所示。在0～25ug / ml 浓度范围内，随着羟脯氨酸含量的增加，A560nm值也增加,即羟脯氨酸含量和所测得的A560nm 值之间成正向线性关系。

3，从酶标仪测定结果来看，在取相同液量的情况下，传统方法测得HYP含量平均值为

0.7789ug/ml；胃酶酸解法测得HYP含量平均值为3.9321ug/ml，是传统方法的5倍，说明此法比传统方法更加敏感，可信度较高。

4，胃酶酸解法测得HYP含量范围为2.955ug/ml－4.500ug/ml，平均为3.921ug/ml；传统方法测得HYP含量范围为0.045ug/ml－1.547ug/ml，平均0.7789ug/ml，两者比较有显著性差异（t ＝19.127， p＜0.01）。具体结果见表1

表1，两种方法对肝组织HYP含量的测定结果（ug/ml）

编号胃酶酸解法传统盐酸水解法

1 2.955 0.289

2 3.271 0.176

3 3.816 0.045

4 3.961 0.421

5 3.800 1.461

6 3.922 0.747

7 3.947 0.439

8 3.882 0.876

9 3.842 1.442

10 4.082 0.953

11 3.900 1.179

12 4.189 1.547

13 4.460 0.292