蛋白质分离技术2
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1、凝胶层析的特点及应用
• 特点:设备简单、操作方便、样品回收 率高、实验重复性好、特别是不改变样 品生物学活性等优点。
• 用途:蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生 物分子的分离纯化,同时还应用于蛋白 质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
2、凝胶层析的原理
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶 颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。
(2)琼脂糖凝胶(Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构,琼脂糖密度越大,网状结
构越密集。 (3)聚丙烯酰胺
一种人工合成的凝胶,以丙烯酰胺为单位,由甲叉双丙烯酰胺交联 而成。交联剂越多,孔隙度越小。 商品名为生物胶—P(Bio-Gel P). (4) 聚丙乙烯凝胶(Styrogel) 大网孔结构。
3. 凝胶的种类和性质
(1)交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2) SephadeX LH—20,是Sephadex G—25的羧丙基衍生物,溶于 水和亲脂性溶剂,用于分离不溶于水的物质。
5.0±0.3
9-11
1500-30000
500-10000
6
2
超细 10-40
Sephadex G-75
中粗 超细
40-120 10-40
7.5±0.5 12-15
3000-70000
1000-50000
24
3
Sephdex G-100
中粗 40-120 超细 10-40
10±l.0 15-20 4000-150000 1000-100000
(二)排阻层析 (凝胶层析)
凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层 析分离的方法,均称之为排阻层析。
用于层析的分离介质称为排阻层析介质。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯
酰胺等为原料,通过特殊工艺合成的层析介质。 目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药 的研究和生产中必不可少的分离介质。
48
5
Sephadex G-150
中粗 超细
40-120 10源自文库40
15±1.5 20-30 5000-400000 1000-150000
72
5
Sephadex 中粗 G-200 超细
40-120 10-40
20±2.0 30-40 5000-800000 1000-200000
72
5
最大流体 静力压/Pa (cmH2O) >9810(100) >9810(100)
>9810(100)
>9810(100)
4905(50) 3434(35) 1472(15) 981(10)
4. 层析柱的重要参数
• ⑴柱体积:柱体积是指凝胶装柱后,从 柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色 谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床,因 引柱体积又称“床”体积,常用Vt 表示。 ⑵外水体积:色谱柱内凝胶颗粒间隙, 这部分体积称外水体积,亦称间隙体积, 常用Vo表示。
700
700
3
1
40-120 1.5±0.2 2.5-3.5
1500
1500
3
1
粗 100-300
Sephadex 中粗
G-25
细
50-150 20-80
2.5±0.2
4-6
1000-5000
100-5000
6
2
超细 10-40
粗 100-300
Sephadex G-50
中粗 细
50-150 20-80
四、层析技术
• 层析法也称色谱法,是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填 有吸附剂的柱子,各种色素以不同的速率流动后形成 不同的色带而被分开,由此得名为“色谱法” (Chromatography) 。
• 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 • 1944年出现纸层析。 • 以后层析法不断发展,相继出现薄层层析、气相层析、
• ⑶内水体积:因为凝胶为三维网状结构,颗粒内部 仍有空间,液体可进入颗粒内部,这就分间隙的总 和为内水体积,又称定相体积,常用Vi表示。 不包 括固体支持物的体积(Vg)。 ⑷峰洗脱体积:是指被分离物质通过凝胶柱所需洗 脱液的体积,常用Ve 表示。
• 当使用样品的体积很少时,(与洗脱体积比较可以 忽略不计),在洗脱图中,从加样到峰顶位置所用 洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能 忽略时,洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰 顶位置。当样品很大时,洗脱体积计算可以从应用 样品开始到洗脱峰升高的弯曲点(或半高处)。
概念(排阻层析,分子筛层析):当生物大分子通过装
有凝胶颗粒的层析柱时,根据它们分子大小不同而进 行分离的技术。
原理:凝胶颗粒内部具有多孔网状结构,被分离的混合
物流过层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶 孔内,在凝胶颗粒之间的空隙向下移动,并最先被洗 脱出来;比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶 孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢,最后 被洗脱出来。
品名
Sephadex G-1O Sephadex G-15
葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性
干胶颗粒 直径/μm
得水值 Wf/g.g-1
床体积 /mL.g-1
最适分段分离范围
球蛋白分 线性葡聚糖 子质量/Da 分子质量/Da
溶胀所需 时间/h
20℃
lOO ℃
40-120 1.0±0.1 2-3
高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等。
(一)层析的分类
• 按层析的分离机理分类
• 排阻层析(exclusion chromatography) • 离子交换层析(ion exchange chromatography) • 吸附层析(absorption chromatography) • 分配层析(partition chromatography) • 亲和层析(affinity chromatography) • 金属螯合层析(metal chelating chromatography) • 疏水层析(hydrophobic chromatography) • 反向层析(reverse phase chromatography) • 聚焦层析(focusing chromatography) • 灌注层析(perfusion chromatography)