肠道微生物体外模型研究进展
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．5肠道微生物生态的非流动性发酵系统以上的大多数系统其细菌数目和细菌种类都存在一定的变异性，而且需要 较长时间才能达到稳定状态。有的研究者认为这种不稳定性可能是由于随意的移去细菌细胞和培养基而导致的。由于是随意的移去细菌细胞和培养基，所以一些活的细菌细胞和未 利用完全的培养基也被移除掉，而理想的情况是只移除死亡了的细菌细胞和已充分利用了的培养基。为了克服以上这些系统固有的困难和缺陷CINQUIN等2004年提出了一种新 型的发酵模型。他们设计了一层膜，把来自婴儿粪便的微生 物放到多糖基质上去发酵，这样既可以连续发酵又不移掉细 胞来确保那些需要定植才能生长的细菌不被移除掉。从而增
Vessel 2系统模拟小肠部位，反应体积为0．3 L，保留时间为6 h，pH控制在5．0～6．0。Vessel 3、Vessel 4、Vessel 5三相反应系统模拟升结肠、横结肠、降结肠部位，反应体积分别是．7、1．3、0．8 L;保留时间为18、36、22 h; pH分别控制在5．5～6．0、6．0～6．4、6．6～6．9。因为模拟小肠的生理生化过程，该模型在Vessel 2内通过蠕动泵添加含有水解酶的胰腺提取液。MOLLY等设计了含有阿拉伯糖、果胶、木聚糖、糊精、淀粉5种不同碳源的培养基研究不同营养组分对肠道菌群的影响。通过测定了菌群数量、挥发性脂肪酸、19种酶活性等数据和人体内数据相比较，发现数据之间比较吻合，证明了此模型能可以模拟人体肠道来研究微生物菌群互作和变化规律。之上述模型多了模拟食糜从胃到小肠的这个过程更加接近人体正常生理学的过程.MINEKUS等介绍了一种新型的发酵系统，这种系统包括四个玻璃单元互相连接，其每个单元中有一个灵活的壁。这个系统控制在37℃ ，然后通过电脑控制挤压玻璃单元内壁使得代谢物能够在四个单元间流动。系统内的微生物吸收水和代谢物质需要过内置的中空纤维膜，食糜混合和运输则借助蠕动泵实现。这个系统在难消化食物成分和微生物的代谢及大肠微生态方面研究 上有重要的作用［11］。虽然此模型比以往模型更加自动智能化，但由于其系统挤压玻璃单元在设计和制造方面存在着一 定的困难，尤其是中空纤维膜内置与电脑连接过于复杂，其应用并不太广泛。
加了系统wk.baidu.com模拟效果和稳定性。
肠道微生物体外模型研究进
随着分子微生态学，特别是高通量测序技术的发展，人类对肠道微生物的作用有了新的突破性认识。我们现在了解到人体和动物消化道系统中生长着大量的细菌，肠道中细菌的总数量甚至高出人体细胞总数的十倍。肠道微生物的菌群多样性受到多种因素的影响。其中环境和宿主的遗传背景在决定肠道菌群结构和组成方面各自起到50%的作用。而且由于外部环境在肠道菌群结构形成过程中的巨大影响，个体之间肠道菌群结构和组成极为不同。目前的研究证明只有极少数的细菌存在于大多数人的肠道中。而个人之间菌群结构的不同反过来又直接影响到宿主的免疫系统发育和营养物质的吸收，甚至和自身免疫性疾病的产生相关。肠道微生物现在认为是人体的一个新“器官”。而肠道微生物生态的研究近十年来也受到了广泛的重视。但是肠道微生物研究存在的重要的瓶颈在于样品的采集。对正常人来说，除了收集粪便之外，小肠、升结肠、横结肠等部位的取样几乎不现实。另一方面，由于肠道细菌受到外部环境和宿主肠道环境的双重影响，如何区分外部环境和肠道内环境对肠道菌群的作用变得十分重要。所以，建立合理而易操作的体外模型对推动肠道微生态学、人体和动物营养学的发展非常有意义。本文就国内外目前经常使用的用于肠道微生态研究的体外肠道模型做一简单介绍。
体外肠道模型的发展
1静止发酵或罐批量培养模型此模型为最原始、最简单的体外发酵模型。该发酵在小瓶子中或者pH控制的批量发酵罐中进行。具体做法为在批量发酵罐中接入动物肠内容物或人粪便菌群的悬浮液，培养基中含有不同的待测碳水化合物或蛋白质，整个发酵过程在充满氮气或二氧化碳的下进行。该模型简单、易操作，可以同时对多种底物进行比较，所以用于对碳水化合物的初步筛选。缺点是只能用于短期的发酵研究，因为培养物内pH和营养物水平变化很快群的改变导致该模型对肠道环境的模拟效果不理想。而且，由于死亡的细菌不能及时从发酵系统中清理出去，如果采用分子生态学的检测手段，如荧光定量PCR或FISH等方法无法区别死亡细菌还是活细菌，所以该模型不适用于使用16S rRNA的分子生态学实验手段来测定菌群的变化，使用范围有比较大的局限性。但常规微生态学手段，如采用选择性培养基培养活细菌的方法还是能够测定菌群变化的。由于24 h之后培养基中养分已被大量消耗，而发酵终产物不断累积，长时间培养结果离肠道实际内环境偏差很大。GIBSON和FULLER报道用此模型进行研究在48 h内结果还是比较稳定可靠.
1．3人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物小肠的微生物。1993年MOLLY等设计了一个五相反应器，命名为人类肠道微生态模拟器。该模拟系统被认为能够全方位，更好的的模拟人体肠道内的微环境。如图2所示，该系统温度仍然保持在37℃。其中Vessel l模拟的是胃环境，反应体积是0．2 L，保留时间为2 h，pH控制在2．0～2．5。1．3人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物生态过程，没有涉及胃和
2连续发酵培养系统食糜在人体和大部分单胃动物消化系统中按照口到肛门的单方向流动，所以肠道细菌在单胃动物肠道中的发酵可以看做是一种恒温连续发酵的过程。发酵工艺中连续发酵的特点和肠道发酵特点比较接近，所以通过恒化连续发酵工艺从理论上可以模拟肠道细菌发酵的自然过程。COATES等首先设计了连续发酵培养系统，在这个系统中可以连续的加入新鲜培养基同时移除使用过的废液。随着设计工艺和制造技术的不断发展，研究人员已经可以在体外控制这个连续培养系统的pH、温度、氧化还原能和营养状态等，来控制发酵罐中细菌的数量与菌群结。最原始的连续培养是单相连续发酵模型。但由于大肠环境的复杂性及不同肠道位置的解剖结构和环境存在差异，单相连续发酵模型的局限性越来越明显，继而GIBSON和MACFARLAN等根据人体结肠的生理特点建立了三相连续发酵模型，同时通过比较该群的结构特点和突然死亡的人体肠道菌群的生理生化指标之间的相关性，对该模型的可靠性进行了验证。研究结果表明三相连续发酵模型能较好的模拟各个肠道解剖位置，即升结肠、横结肠和降结肠环境中肠道菌群的实际结构。现在常用的三相连续发酵系统由三个发酵瓶V1、V2和V3串联而组成，它们各自的容积分别为0．22、0．32和0．32升，分别代表升结肠、横结肠和降结肠的生理位置。根据人体肠道不同解剖位置的实际生理特点，三个罐的pH分别控制在5．5、6．2和6．8，整体温度控制在37℃。每个发酵瓶都用磁力搅拌器以一定速度进行搅拌以混匀培养基，同时充入无氧氮气，以维持发酵瓶的厌氧环境。如图1所示，培养基从培养瓶依次流入V1，再从V1流入V2，V2流入V3，最后从V3流入废液罐中。其营养物质的流向和人体结肠中营养物质的流同。连续培养模型目前广泛应用在肠道细菌的生理、生化研究
Vessel 2系统模拟小肠部位，反应体积为0．3 L，保留时间为6 h，pH控制在5．0～6．0。Vessel 3、Vessel 4、Vessel 5三相反应系统模拟升结肠、横结肠、降结肠部位，反应体积分别是．7、1．3、0．8 L;保留时间为18、36、22 h; pH分别控制在5．5～6．0、6．0～6．4、6．6～6．9。因为模拟小肠的生理生化过程，该模型在Vessel 2内通过蠕动泵添加含有水解酶的胰腺提取液。MOLLY等设计了含有阿拉伯糖、果胶、木聚糖、糊精、淀粉5种不同碳源的培养基研究不同营养组分对肠道菌群的影响。通过测定了菌群数量、挥发性脂肪酸、19种酶活性等数据和人体内数据相比较，发现数据之间比较吻合，证明了此模型能可以模拟人体肠道来研究微生物菌群互作和变化规律。之上述模型多了模拟食糜从胃到小肠的这个过程更加接近人体正常生理学的过程.MINEKUS等介绍了一种新型的发酵系统，这种系统包括四个玻璃单元互相连接，其每个单元中有一个灵活的壁。这个系统控制在37℃ ，然后通过电脑控制挤压玻璃单元内壁使得代谢物能够在四个单元间流动。系统内的微生物吸收水和代谢物质需要过内置的中空纤维膜，食糜混合和运输则借助蠕动泵实现。这个系统在难消化食物成分和微生物的代谢及大肠微生态方面研究 上有重要的作用［11］。虽然此模型比以往模型更加自动智能化，但由于其系统挤压玻璃单元在设计和制造方面存在着一 定的困难，尤其是中空纤维膜内置与电脑连接过于复杂，其应用并不太广泛。
加了系统wk.baidu.com模拟效果和稳定性。
肠道微生物体外模型研究进
随着分子微生态学，特别是高通量测序技术的发展，人类对肠道微生物的作用有了新的突破性认识。我们现在了解到人体和动物消化道系统中生长着大量的细菌，肠道中细菌的总数量甚至高出人体细胞总数的十倍。肠道微生物的菌群多样性受到多种因素的影响。其中环境和宿主的遗传背景在决定肠道菌群结构和组成方面各自起到50%的作用。而且由于外部环境在肠道菌群结构形成过程中的巨大影响，个体之间肠道菌群结构和组成极为不同。目前的研究证明只有极少数的细菌存在于大多数人的肠道中。而个人之间菌群结构的不同反过来又直接影响到宿主的免疫系统发育和营养物质的吸收，甚至和自身免疫性疾病的产生相关。肠道微生物现在认为是人体的一个新“器官”。而肠道微生物生态的研究近十年来也受到了广泛的重视。但是肠道微生物研究存在的重要的瓶颈在于样品的采集。对正常人来说，除了收集粪便之外，小肠、升结肠、横结肠等部位的取样几乎不现实。另一方面，由于肠道细菌受到外部环境和宿主肠道环境的双重影响，如何区分外部环境和肠道内环境对肠道菌群的作用变得十分重要。所以，建立合理而易操作的体外模型对推动肠道微生态学、人体和动物营养学的发展非常有意义。本文就国内外目前经常使用的用于肠道微生态研究的体外肠道模型做一简单介绍。
体外肠道模型的发展
1静止发酵或罐批量培养模型此模型为最原始、最简单的体外发酵模型。该发酵在小瓶子中或者pH控制的批量发酵罐中进行。具体做法为在批量发酵罐中接入动物肠内容物或人粪便菌群的悬浮液，培养基中含有不同的待测碳水化合物或蛋白质，整个发酵过程在充满氮气或二氧化碳的下进行。该模型简单、易操作，可以同时对多种底物进行比较，所以用于对碳水化合物的初步筛选。缺点是只能用于短期的发酵研究，因为培养物内pH和营养物水平变化很快群的改变导致该模型对肠道环境的模拟效果不理想。而且，由于死亡的细菌不能及时从发酵系统中清理出去，如果采用分子生态学的检测手段，如荧光定量PCR或FISH等方法无法区别死亡细菌还是活细菌，所以该模型不适用于使用16S rRNA的分子生态学实验手段来测定菌群的变化，使用范围有比较大的局限性。但常规微生态学手段，如采用选择性培养基培养活细菌的方法还是能够测定菌群变化的。由于24 h之后培养基中养分已被大量消耗，而发酵终产物不断累积，长时间培养结果离肠道实际内环境偏差很大。GIBSON和FULLER报道用此模型进行研究在48 h内结果还是比较稳定可靠.
1．3人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物小肠的微生物。1993年MOLLY等设计了一个五相反应器，命名为人类肠道微生态模拟器。该模拟系统被认为能够全方位，更好的的模拟人体肠道内的微环境。如图2所示，该系统温度仍然保持在37℃。其中Vessel l模拟的是胃环境，反应体积是0．2 L，保留时间为2 h，pH控制在2．0～2．5。1．3人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物生态过程，没有涉及胃和
2连续发酵培养系统食糜在人体和大部分单胃动物消化系统中按照口到肛门的单方向流动，所以肠道细菌在单胃动物肠道中的发酵可以看做是一种恒温连续发酵的过程。发酵工艺中连续发酵的特点和肠道发酵特点比较接近，所以通过恒化连续发酵工艺从理论上可以模拟肠道细菌发酵的自然过程。COATES等首先设计了连续发酵培养系统，在这个系统中可以连续的加入新鲜培养基同时移除使用过的废液。随着设计工艺和制造技术的不断发展，研究人员已经可以在体外控制这个连续培养系统的pH、温度、氧化还原能和营养状态等，来控制发酵罐中细菌的数量与菌群结。最原始的连续培养是单相连续发酵模型。但由于大肠环境的复杂性及不同肠道位置的解剖结构和环境存在差异，单相连续发酵模型的局限性越来越明显，继而GIBSON和MACFARLAN等根据人体结肠的生理特点建立了三相连续发酵模型，同时通过比较该群的结构特点和突然死亡的人体肠道菌群的生理生化指标之间的相关性，对该模型的可靠性进行了验证。研究结果表明三相连续发酵模型能较好的模拟各个肠道解剖位置，即升结肠、横结肠和降结肠环境中肠道菌群的实际结构。现在常用的三相连续发酵系统由三个发酵瓶V1、V2和V3串联而组成，它们各自的容积分别为0．22、0．32和0．32升，分别代表升结肠、横结肠和降结肠的生理位置。根据人体肠道不同解剖位置的实际生理特点，三个罐的pH分别控制在5．5、6．2和6．8，整体温度控制在37℃。每个发酵瓶都用磁力搅拌器以一定速度进行搅拌以混匀培养基，同时充入无氧氮气，以维持发酵瓶的厌氧环境。如图1所示，培养基从培养瓶依次流入V1，再从V1流入V2，V2流入V3，最后从V3流入废液罐中。其营养物质的流向和人体结肠中营养物质的流同。连续培养模型目前广泛应用在肠道细菌的生理、生化研究