多克隆抗体制备
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②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少；
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
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再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
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免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
•
剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
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鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
• 免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血 清滴度测定）
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免疫应答
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。
(一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)， 是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和 递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。 ( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又 称反应阶段(reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化， 进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞 增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并 产生多种细胞因子；B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部 分 T、B 淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段， 有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加。 (三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫 效应的过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种 类应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。
二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
只，小动物产约生0抗.体1～。使0.无6免mg疫/原只性。物如质变无成免有疫效的佐 剂可适当提免（高疫6）免原改；疫变剂抗体量的（产1生0类-2型0以倍及）产。生迟发
• 乳化：一般型抗变原态反与应免，疫并使佐其剂增体强。积比1:1混合。
首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不
完全佐剂。
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免疫方式
• 注射途径：免疫注射的途径也很重要。一 般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背 部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮 内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价 有利
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免疫方式
• 间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物 机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如 很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫 抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以 后每次的间隔一般为7～10天，不能太长， 以防刺激变弱，抗体效价不高。
血液采集
采血量底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合
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家兔
家兔是最适合制备抗体的动物。 •其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量 可达25～50ml,全放血量则达100～180ml; •性格驯顺,易于操作和采血; •寿命相对较长,为5～8年; •能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清； •通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体； •家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容 易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段
•抗原亲和纯化 多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上，然后与抗血清孵育以捕获相应的抗 体，然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体， 最后再将抗体洗脱下来
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初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为：
①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期；
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
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再次应答(secondary response)
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
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免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
•
剂量：免疫（原2）合增适加剂抗原量的的表选面积定；应考虑抗原 性强弱、分（（子34））量佐增大剂强小能辅刺助和激T细免吞胞疫噬的细时作胞用间对；。抗原大的动处物理；
抗原剂量（（以5）蛋刺白激抗致敏原淋为巴准细胞）的约分0裂.和5～浆细1m胞g/
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鸡
鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可 保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体 的过程称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主要特点为： ①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的 一半； ②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍 到几十倍，而且维持时间长； ③诱发再次应答所需的抗原剂量极小； ④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM 很少，抗体的平均亲和精品课力件 高。如果再次应答
• 免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血 清滴度测定）
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免疫应答
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。
(一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)， 是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和 递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。 ( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又 称反应阶段(reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化， 进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞 增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并 产生多种细胞因子；B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部 分 T、B 淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段， 有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加。 (三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫 效应的过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种 类应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。
二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
只，小动物产约生0抗.体1～。使0.无6免mg疫/原只性。物如质变无成免有疫效的佐 剂可适当提免（高疫6）免原改；疫变剂抗体量的（产1生0类-2型0以倍及）产。生迟发
• 乳化：一般型抗变原态反与应免，疫并使佐其剂增体强。积比1:1混合。
首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不
完全佐剂。
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免疫方式
• 注射途径：免疫注射的途径也很重要。一 般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背 部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮 内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价 有利
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• 间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物 机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如 很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫 抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以 后每次的间隔一般为7～10天，不能太长， 以防刺激变弱，抗体效价不高。
血液采集
采血量底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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•蛋白A亲和层析 蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合
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家兔
家兔是最适合制备抗体的动物。 •其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量 可达25～50ml,全放血量则达100～180ml; •性格驯顺,易于操作和采血; •寿命相对较长,为5～8年; •能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清； •通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体； •家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容 易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段
•抗原亲和纯化 多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上，然后与抗血清孵育以捕获相应的抗 体，然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体， 最后再将抗体洗脱下来
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初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为：
①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期；