第四章沉淀法

4.２盐析
Salt induced precipitation
盐析
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的 早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分 离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和 分级中使用，得到了比较满意的结果。
概述
沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，
这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响 这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液 的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度， 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分 离的目的， 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶 液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶 解度产生明显的改变。
盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。
（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的 大分子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保 护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质 形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。 （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电 的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自 身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。
收率和沉淀物的形状都有很大影响。
沉淀生成动力学
溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不 稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认 为相互碰撞由下面几种运动引起：
①热运动，Bromnian运动； ②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。
沉淀生成动力学
为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀
蛋白质的溶解特性
蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸 组成。
在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性 氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨 基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
概述
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备， 且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择 性不强
沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8）选择性沉淀法。
质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降 低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而 沉淀。
PH＜PI，带正电荷， 又有水膜，是稳定的
亲水胶体
+ ++
+
+
+
+
+
+
+ ++
在等电点状态的 酶蛋白，水膜未脱， 是不稳定的亲水胶体
H+
+_
_+
_
OH- + _ +
PH＞PI，带负电荷， 又有水膜是稳定的 亲水胶体
概述
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。
操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
概述
沉淀法操作步骤： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、
亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外 表面。
因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷 电区、亲水区和疏水区构成。
蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域
蛋白质的溶解特性
蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周 围溶液性质所决定。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大 部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。
（2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和 电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
1）盐析用盐的选择
盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
盐析用盐的选择
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子
OH-
__ _ __
H+ _ _ _
中性盐 破坏水膜
中性盐 破坏水膜
中性盐 破坏水膜
+
+
+
中性盐中和其电荷
+
பைடு நூலகம்
+
+ +
+ +
SO24- 等
_ __
_ 中性盐中和其电荷
_
NH4+或Na+等
___
蛋白质沉淀
盐析机理示意图
盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况：
（1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲)
复性
细胞破碎 碎片分离
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附)
脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤)
精制(结晶、干燥)
4.1 概述
沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低 而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需 成分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目 前仍广泛应用在工业上和实验室中。