林业生物技术课件10.转基因植物及其应用

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1、植物基因工程载体及其构建
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1、植物基因工程载体及其构建
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1、植物基因工程载体及其构建 植物细胞受伤
产生酚类物质 （乙酰丁香酮）
激活根癌农杆菌 受体virA 信号传递
激活virG 诱导表达
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1、植物基因工程载体及其构建
1.3 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
根癌农杆菌，含有Ti质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 形成肿瘤，即诱发冠瘿碱
T-DNA区
细胞分类素 合成基因
发根农杆菌，含有Ri质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 产生毛发状根
生长素 合成基因
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1、植物基因工程载体及其构建
1.2 植物基因工程受体系统
原生质体。外源DNA易导入、基因型一致、适合各 种转化方法、遗传稳定性差、培养技术难度大。 愈伤组织。外源DNA易导入、适合各种转化方法、 可继续扩繁、遗传稳定性差、嵌合体高。 种质系统。外源DNA易导入、可简化或缩短育种纯 化过程、受季节限制。 胚状体。外源DNA易导入、变异小。 直接分化芽。变异小、操作简单周期短、有嵌合体。
多次筛选培养
生根培养
转基因植株
外源基因组织化学检测、 分子检测
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2、植物遗转化方法和技术
2.2 直接转化
采用基因枪法获得转基因植物
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2、植物遗转化方法和技术
PEG(聚乙二醇)法，细胞融合剂，是外源DNA形成 可被植物原生质体主动吸收的DNA沉淀。 电激法，利用高压电脉冲作用，使原生质膜的结 构改变并形成可逆性的开闭通道，从而使原生质 体易吸收外源DNA。 显微注射转化法，利用显微注射仪将外源DNA直 接注入受体细胞的细胞核或细胞质中。 其他转化方法，超声波、脂质体等
激活诱导其他基因表达
T-DNA进入染色体
在VirD2、 VirD4和VirB作用下
T-DNA单链与VirD2结合 VirD1、 VirD2协助
T-DNA单链释放
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 Ti质粒的改造与载体构建
双元载体
多克隆 位点
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1、植物基因工程载体及其构建
绿色荧光蛋白基因（GFP），来自水母。但野生 型GFP发光较弱，甚至在某些植物中不表达，为 适应在植物研究中的应用，已有许多改造的gfp 可满足研究的需要。
冠瘿碱合成酶基因。nos和ocs存在于农杆菌TDNA上，因其启动子是真核型，在农杆菌中不表 达， 故通过检测转化体中冠瘿碱的存在可确定 外源基因的表达。
其他选择标记。
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 .2 报告基因
报告基因
Reporter gene，是编码一种易于检测蛋白质 或酶的基因，通过它的瞬时及稳定表达来检测目 的基因是否转化成功，起报告作用。
β-葡萄糖酸酶基因（gus），来自大肠杆菌，在 一定条件下与其底物X-Glucuionic acid作用会 使有GUS活性的细胞染成蓝色。
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 植物遗传转化中常用的选择标记基因及报告基因
1.5 .1选择标记
磷酸新霉素转移酶基因（nptⅡ）。由它编码的 产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶对某些氨基葡萄糖 苷类抗生素如卡那霉素、庆大霉素等有抗性。
潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。通过酶促磷酸 化作用使潮霉素发生磷酸化而失活，因此在含潮 霉素B的培养基中，含有该标记基因的植株能存 活，不含则死亡。
RB
Vir区
在植物基因转化上应用最多的是根癌农杆菌Ti质粒
冠瘿碱 合成基因
LB
冠瘿碱 代谢基因
复制起始区
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1、植物基因工程载体及其构建
T-DNA区。是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该 DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。
中间克隆载体。是大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基 因、标记基因等构建而成，是构建中间表达载体的基础 质粒。
中间表达载体。是含有植物特异启动子和转录终止子的 中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。
卸甲载体。是解除武装Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为 构建转化载体的受体质粒。
植物基因转化载体。是最后用于目的基因导入植物细胞 的载体，又称为工程载体。
林业生物技术课件10.转基因植物及 其应用
思考讨论
1、农杆菌法构建转基因植物的原理？
2、什么叫DNA克隆？cDNA克隆与基因组克 隆有何不同？
3、基因工程安全措施？
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1、植物基因工程载体及其构建
1.1 植物基因工程载体种类
目的基因克隆载体。是由多拷贝的大肠杆菌（E.coli） 小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。
花青素合成有关的基因。
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2、植物遗转化方法和技术
2.1 载体转化
植物受体材料 （植物细胞、组织、器官等）
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
含植物转化载体的农杆菌菌液
浸染（10-20min） 共培养（2-4h）
田间试验、遗传分析、形状鉴定
选择诱导分化 （培养基+选择压+抑菌剂，约4周）
Vir区。即毒性区，又称致瘤区域，其长度约 35kb。
Con区。该区段上存在着与细菌间接合转移的有 关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
Ori区。该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故 称为复制起始区。
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1、植物基因工程载体及其构建
1.4 Ti质粒基因转化的原理
根癌农杆菌Ti质粒介导的转化过程主要包括： ① 细菌在植物敏感细胞上的吸附 ② 农杆菌中Ti质粒上的Vir区基因被激活 ③ T-DNA切割和T-DNA复合物形成 ④ T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞 ⑤ T-DNA以单或多拷贝随机整合到植物基因组并
进行表达。
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