大肠埃希氏菌的两种标准检验方法的准确性比较

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关键词： 大肠埃希氏菌（ ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ； 标准； 准确性 中图分类号： Ｒ ３７８．２＋１－ ３４
１ 前言 国家标准《致泻大肠埃希氏菌检验 》（ ＧＢ４７８９．６－
９４ ）（ 以 下 简 称 ＧＢ 法 ） 对 大 肠 埃 希 氏 菌 是 定 性 检 验 ； 行业标准《出 口食品中大肠菌群， 粪大肠 菌 群 和 大 肠 杆菌 检验方法 》（ ＳＮ０１６９－ ９２ ）（ 以 下 简 称 ＳＮ 法 ） 对 大肠埃希氏菌是定量检验， 其中包含定性检验内容。 单就定性检验而言， ＧＢ 法和 ＳＮ 法同样检验大肠埃希
摘 要： 按照大肠埃希氏菌的生化性状， 对国家标准《致泻大肠埃希氏菌检验》（ ＧＢ４７８９．６－ ９４ ） 和行业标准《出 口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》（ ＳＮ０１６９－ ９２ ） 进行分析比较。得出国家标准对大肠埃希氏菌 的检验准确性更高， 而行业标准的检验存在着漏检问题， 所以， 在选用标准时应引起注意。
表 ３ 非目标菌接种培养物的计数结果
非目标菌接菌量（ｃｆｕ／ 管）
４．５ ×１０３ ４．５ ×１０５
不 同 培 养 基 细 菌 增 长 结 果（ｃｆｕ／１０μＬ）
ＬＢ Ｆｒａｓｅｒ ＵＶＭ ＥＢ ＢＬＥＢ
０
０
０
０
０
０
０
６１ ００
０
受的从食品中分离单增李斯特氏菌的传统方法包括美 国 食 品 药 品 局（ ＦＤＡ ） 的 方 法 、 官 方 分 析 化 学 家 协 会 （ ＡＯＡＣ ） 的官方方法、ＩＳＯ １１２９０ 标准、美国农业部 （ ＵＳＤＡ ） 食 品 安 全 监 察 局（ ＦＳＩＳ ） 的 方 法 以 及 法 国 的 标准等。为了选择出适合奶粉中单增李斯特氏菌检测 的增菌肉汤， 本研究将这些国际标准和方法中推荐使 用的液体培养基进行了比对， 通过比较， 发现这些培 养基对奶粉中单增李斯特氏菌的富集效果差异不明 显。可能的原因主要有： 单增李斯特氏菌的抵抗力很 强， 在多种环境条件下生长良好， 而且乳粉营养成分 充分， 可以在很大程度上满足菌体生长的需要， 所以 各种培养基由于营养成分之间差异很小， 从而对其生 长的影响并不大。 ４．２ 李 斯 特 氏 菌 增 菌 肉 汤 中 常 用 的 选 择 性 试 剂 主 要 为 吖啶黄素和耐啶酮酸， 如果有真菌存在， 可以选择抗 真菌剂， 常用的是放线菌酮。由于匹马霉素（ 游霉素） 与放线菌酮相比， 匹马霉素毒性较小， 可推荐作为另 一种抗真菌剂。在本研究的培养基选择效果比较中， 每种培养基均使用了吖啶黄素和耐啶酮酸抑菌剂， 而
参考文献
［１］ Ｏｆｆｉｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ． Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ［ＥＢ］． Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ａｎｉｍａｌｓ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００４． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｉｅ．ｉｎｔ／ｆｒ／ｎｏｒｍｓ／ｍｍａｎｕａｌ／Ａ＿００１４０． ｈｔｍ．
综上所述， 由于 ＳＮ 法 在 认 定 乳 糖 发 酵 和 高 温 培 养 筛 选 两 个 步 骤 上 存 在 着 漏 检 问 题 ， 和 ＧＢ 法 相 比 ， 其 准 确 率 较 低 。所 以 在 定 性 检 验 方 面 ， ＳＮ 法 不 能 代 替 ＧＢ 法， ＳＮ 法至少漏检致泻病菌： 肠道侵袭性大肠 埃 希 氏 菌（ ＥＩＥＣ ） 和 部 分 肠 道 致 病 性 大 肠 埃 希 氏 菌 （ ＥＰＥＣ） 。相反， ＧＢ 法可以代替 ＳＮ 法。当然， 在定 量检验方面， ＳＮ 法仍具有实用性。ＧＢ 法也可以参照 ＳＮ 法 的 定 量 方 法 进 行 定 量 检 验 ， 这 还 有 待 于 进 一 步 探索。此外， ＧＢ 法比 ＳＮ 法更简单快捷， 缩短了检验 时间 ７ｄ。
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２００７ 年第 ４ 期 Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．４
检验检疫科学 ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＳＣＩＥＮＣＥ
气， ＩＭＶｉＣ 试验为＋ ＋ － － 或－ ＋ － － 。它认定大肠 埃希氏菌是全部发酵乳糖的。而 ＧＢ 法在标准中描 述 大肠埃希氏菌为： ＴＳＩ 斜面产酸或不产酸， 底层产酸， Ｈ２Ｓ 阴性， ＫＣＮ 阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希 氏菌。文中未提大肠埃希氏菌只发酵乳糖， 葡萄糖或 蔗糖发酵亦可。所以 ＧＢ 法认定大肠埃希氏 菌发酵乳 糖的同时， 还认定乳糖发酵迟缓和不发酵乳糖的大肠 埃希氏菌。这体现在选择性增菌和划线分离两个步骤 上。 ２．１．１ 在选择性增菌上， ＳＮ 法用的月桂基硫酸盐胰蛋 白 （ＬＳＴ）肉 汤 和 ＥＣ 肉 汤 中 都 以 乳 糖 为 发 酵 糖 类 ， 并 以 分 解 乳 糖 产 气 为 指 标 ， 筛 选 大 肠 埃 希 氏 菌 ； ＧＢ 法则不同， 不但有发酵乳糖的选择性增菌培养基： 乳 糖胆盐发酵管， 还有发酵葡萄糖的选择性增菌培养 基— ——肠道菌增菌肉汤， 增加了一条增菌途径。这样 就不会漏选乳糖发酵迟缓和不发酵乳糖的菌株。因为 这些菌株能利用葡萄糖在肠道菌增菌肉汤中很好生长。 ２．１．２ 在 划 线 分 离 平 板 上 ， ＳＮ 法 只 选 择 “ 黑 色 中 心 ” 的菌落 ， 即 乳 糖 发 酵 的 菌 落 ； ＧＢ 法 挑 选 菌 落 “不 但 要注意乳糖发酵的菌落， 同时也要注意乳糖不发酵和 迟缓发酵的菌落”。
表 １ 大肠埃希氏菌生化反应
生化项目
乳糖 蔗糖 葡萄糖 氧化酶 靛基质（ Ｉ ） 甲基红（ Ｍ） Ｖ－ Ｐ（ Ｖｉ ） 枸橼酸盐（ Ｃ） 尿素酶 Ｈ２Ｓ ＫＣＮ 生长
ＥＰＥＣ （４２ 株）
７４．６ ４４．２ １００
０ ９４ １００ ０ ０ ０ ０ ０
阳 性 反 应 百 分 率 （％）
ＥＩＥＣ （３５ 株）
氏菌， 其检验方法却大相径庭， 本文按照大肠埃希氏 菌的生化性状， 从如下几个方面来分析比较两种方法 的准确性。 ２ ＧＢ 法和 ＳＮ 法的准确性比较 ２．１ 在认定乳糖发酵上不同
ＳＮ 法 Hale Waihona Puke Baidu 结 果 报 告 中 是 这 样 定 义 大 肠 埃 希 氏 菌 ： 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌， 发酵乳糖产酸产
且在试验中使用的是对数生长期的细菌， 细菌的活性 很高， 不存在细菌损伤的修复过程， 所以培养基的选 择性比较中不会有显著差异。 ４．３ 由 于 乳 粉 的 加 工 是 一 个 复 杂 的 工 艺 过 程 ， 其 间 需 要经过干燥过程和灭菌程序， 奶粉中的单增李斯特氏 菌会受到不同程度的损伤， 对外界环境的抵抗力较 弱， 如果直接增菌， 细菌会对肉汤中的添加剂耐受力 较差， 容易出现假阴性结果。由于 ＢＬＥＢ 的增菌过程 是在预增菌后再 加入 添 加 剂 ， Ｆｒａｓｅｒ 肉 汤 的 增 菌 过 程 是用含有半量添加剂的肉汤预增菌后再转入含有全量 添加剂的肉汤中培养， 这两种方法有利于使损伤的细 菌得以修复， 从而避免假阴性结果。建议对奶粉中单 增李斯特氏菌的富集， 如果采用一步增菌法则选择 ＦＤＡ 方 案 中 的 ＢＬＥＢ， 如 果 采 用 两 步 增 菌 法 则 采 用 ＩＳＯ 方案中的 Ｆｒａｓｅｒ 肉汤。
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Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．４ ２００７ 年第 ４ 期
大肠埃希氏菌的两种标准检验方法的准确性比较
李苏龙 １ 张洪祥 １ 马东升 １ 李卫华 ２ （ １．黑龙江出入境检验检疫局， 黑龙江哈尔滨， １５０００１； ２． 山西出入境检验检疫局， 山西太原， ０３００２４ ）
［２］ ＩＳＯ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｕｆｆｓ－Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ＩＳＯ／ＴＳ１１１３３－２：２００３ ［Ｓ］． Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ， ２００３．
４４℃ 明胶 生长 液化
－
＋－
－
－－
－
－－
＋－－
＋－－
＋－－
＋－＋
培养； ＧＢ 法在采用 ４２℃肠道菌增菌肉汤培养的同时， 还采用了 ３６℃乳糖胆盐发酵管培养。避免了部分大肠 埃希氏菌菌株高温不能生长而被漏检的情况（ 见表 ２） 。
通 过 表 ２ 可 以 看 到 的 ， ＳＮ 法 采 用 高 温 培 养 ， 虽 然筛除了大部分非目标菌， 但同时也漏检了大肠埃希 氏菌Ⅱ和Ⅲ， 存在准确率低的问题。 ２．３ 在生化鉴定上， ＳＮ 法的鉴 定 生 化 项 目 为 靛 基 质 、 甲基红、Ｖ－Ｐ、枸橼酸盐； ＧＢ 法的鉴定生化项目为硫 化氢、氰化钾、尿素酶， 两者鉴定用的生化项目完全 不同， 但是， 按《Ｂｅｒｇｅｙ 氏系统细 菌 学 手 册 》（ 第 九 版 ） 细菌分类生化鉴定方法， 在肠杆菌科范围内， 两 者鉴别的结果是一样的， 不存在哪一种方法鉴定能力 强的问题， 表 １ 中大肠埃希氏菌的生化反应结果也证 实了这一点。 ３ ＧＢ 法和 ＳＮ 法使用上的比较
事实上， 大肠埃希氏菌绝大多数发酵乳糖， 约 ９０％左右， 少数菌株乳糖发酵迟缓或不发酵乳糖， 即 非活跃的大肠埃希氏菌生物群， 如： 肠道侵袭性大肠 埃希氏菌（ＥＩＥＣ）就不发酵乳糖， 肠道致病性 大肠埃希 氏菌部分不发酵乳糖（ 见表 １） ， 如 此 ， ＳＮ 法 漏 检 了 非活跃的大肠埃希氏菌生物群， 易造成假阴性结果。 ２．２ 在高温培养筛选上， ＳＮ 法采用了 ４４．５℃ ＥＣ 肉汤
表 ２ Ｉ Ｍ Ｖｉ Ｃ 试验对大肠菌群的分类
性
菌
名
靛基 甲基红 Ｖ－Ｐ
质 （Ｍ） （Ｖｉ）
（Ｉ）
大肠埃希氏菌 Ⅰ ＋
＋
－
大肠埃希氏菌 Ⅲ ＋
＋
－
大肠埃希氏菌 Ⅱ －
＋
－
枸橼酸杆菌属
－
＋
－
克雷伯氏菌属
＋
－
＋
克雷伯氏菌属， 产气
－
－
＋
肠杆菌
阴沟克雷伯氏菌， 胡
－
－
＋
萝卜软腐欧文氏菌
状
枸橼 酸盐 （Ｃ）
在 实 际 操 作 使 用 上 ， ＳＮ 法 显 得 程 序 繁 多 ， 检 验 时 间 长 ， 阳 性 结 果 至 少 需 要 １０ｄ（ 其 中 增 菌 用 了 ３ｄ， 生化鉴定用了 ４ｄ） ； 而 ＧＢ 法大肠埃希氏菌阳性结果 只需 ３ｄ， 因 此 ＧＢ 法比 ＳＮ 法简单快捷， 缩短 了 检 验 时间 ７ｄ。 ４ 结论
ＥＳＩＥＣ （２０ 株）
０
１００
０
０
１００
１００
０
０
１００
１００
１００
１００
０
０
０
０
０
０
０
０
０
０
其它 （７６ 株）
９０．８ ４８．８ １００
０ ９６ １００ ０ ０ ０ ０ ０
注 ： ＥＰＥＣ： 肠 道 致 病 性 大 肠 埃 希 氏 菌 ； ＥＩＥＣ： 肠 道 侵 袭 性 大 肠 埃 希氏菌； ＥＳＩＥＣ： 肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠埃希氏菌。