_酶分子修饰

二、酶的分子工程
（一）基本内容
1、酶分子改造：
对酶蛋白的主链“切割”，即根据酶的结构与功能的研究， 通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性无关而有碍 应用的部分，提高其活性，增加稳定性。
2、酶分子模拟：
根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机制， 用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、较稳定 的新型催化剂。（模拟酶）
去，而使蛋白质共价结构发生改变。
酶的化学修饰：利用修饰剂所具有的各类化学
基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分 子上的某种氨基酸残基（一般尽可能选用非酶活 必需基团）产生化学反应，从而改造酶分子的结 构与功能。

? 酶化学修饰的方法
（一）金属离子置换修饰 （二）大分子结合修饰 （三）酶分子的侧链基团修饰 （四）肽链有限水解修饰 （五）氨基酸的置换修饰 （六）核苷酸链剪切修饰 （七）物理修饰
一、概念：
利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶 的空间结构发生改变，从而改变酶的特性与功能的 方法。
二、方法（步骤）
1）修饰剂的选择：
? 水溶性大分子修饰剂有：右旋糖苷、聚乙二醇、 肝素、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、羧甲基 纤维素、聚氨基酸等，根据酶分子的结构和修饰 剂的特性选择。
? PEG特点： 溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗原 性，也没有毒性，生物相容性好。
第一节 金属离子置换修饰
一、 概念
通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的 特性和功能发生改变的方法。
二、作用范围
? 含有金属离子的酶 金属酶特点： 金属离子往往是酶活性中心的组成 部分，对酶的活性起重要作用。
（ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活， 重新加入原离子则酶复活。
（ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则 可使酶呈现不同特性。
1、阐明金属离子对酶作用的影响
2、提高酶活力 如:将其它杂离子型的α-淀粉酶都换成钙离子型,会提高酶活 力与稳定性;结晶钙型α-淀粉酶活力比一般结晶杂离子型 α-淀粉酶活力提高3倍以上，稳定性也大增。 蛋白酶(锌型，Zn 2+): 用Ca 2+置换Zn2+成钙型蛋白酶，钙型 蛋白酶活性提高20~30% 。
? PEG生物相容性 已通过美国食品和药物管理局 (FDA) 认证。特别是当酶经过 PEG 类修饰剂修饰后， 修饰剂的许多优良性质也会在修饰蛋白中得到体现。
? PEG 分子末端有两个能被活化的 -OH基团，化学 修饰时则多采用 甲氧基聚乙二醇(MPEG) 的衍生物 为修饰剂（只有一个可被活化的羟基）。
三、步骤
1）酶分离纯化
2）除去原有的金属离子： 酶液中加入一定量金属螯合物，使酶分子中的金属 离子与EDTA 形成螯合物，此时酶成为无活性状态。 通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将 EDTA金属螯合物从酶液中分离除去。
3）加入置换离子： 用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子 结合。
作用：
3、增强酶的稳定性 如: Fe-SOD→Mn-SOD,对H2O2稳定性增强,对NaN3敏感性
显著降低
4、改变酶的动力学特性 包括Km与最适pH 和最适温度等
四、常用的金属离子
? 二价离子： Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn 2+，Co2+， Cu 2+，Fe2+等。
第二节 大分子结合修饰的作用
第六章 酶分子修饰
一、酶分子修饰的原因
? 酶在生物技术中占有核心地位 ? 酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温
和等优点，在工业、农业、医药等方面得到越 来越多的应用。
? 大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种现 象的原因是多方面的，这主要表现在：
(1) 稳定性
? 酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离开 其本身特定的作用环境，在发酵分离提纯、反应、 制剂及固定化等过程中，常常显得不够稳定，不 能适应大量生产条件的需要。
（3）酶的主要动力学性质的不适应
（Km值大，与底物的亲和力小）
? 米氏常数Km值过大，使反应在 低底物浓度 下不能 高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低， 对Km较大的酶用于临床检测或治疗时，影响就更 大。
（4）临床应用的特殊要求
? 绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说 这些酶都是 外源蛋白质 ，具有抗原性，都有可能 引起人体的过敏反应。
2、蛋白质水平
? 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶 的结构。人们用化学法或酶法对酶的一级结构进 行改造。
? 包括酶的一级结构中 氨基酸的置换 ，包括用酶将 肽链切断或部分切除，使酶的空间构象更为稳定。
? 另一方面是 对酶分子中氨基酸残基的修饰 ，即酶 的化学修饰。
（三）酶的化学修饰
蛋白质的化学修饰：通过化学基团的引入或除
? PEG 分子量范围很宽，适合用作修饰剂或修饰剂出 发原料的PEG 的相对分子质量一般为 500 ～20000 。
2）修饰剂的活化：
水溶性大分子需经过活化才能与酶分子的某些侧链基 团进行反应。 常用的大分子修饰剂： 单甲氧基聚乙二醇（ MPEG ） 不同类型的 PEG 衍生物：
（2）作用的最适条件
（pH 中性、室温，溶液状态） 一般酶反应是在基本接近中性，与室温相距不大 的水溶液中进行的。 ? 在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作 用时的pH 常常不在中性范围内。 ? 温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往不稳定， 如果降低温度，又影响反应速度。 ? 底物不溶于水时，酶就更难发挥作用。
? 酶进入人体后也常会由于一些蛋白酶、抑制剂或 抗体的作用而失去其活力，特别是当酶进入体内 以后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤 为明显。
总结: 解决的问题 ？
（一） 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性? （二）如何保护酶活性部位与抗抑制剂? （三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水
解酶? （四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境?
3、酶的化学修饰 ：
即在体外将酶的 侧链基团通过人工方法与一些化 学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价 连接，从而改变酶的酶学性质的技术。
（二）酶的分子工程分类
1、分子生物学水平
? 利用工程方法对 DNA 或RNA 进行分子改造，以 期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合 理的酶蛋白。