核酸序列分析与DNA计算

基本原理
将DNA片段的末端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的 化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一的 DNA片段，这些片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显 影，确定裂解位点碱基的种类和相对排列顺序，从而得出目 的 DNA 的碱基序列。
所用特异性试剂主要是硫酸二甲酯（腺嘌呤 A 的 N2 和鸟 嘌呤 G 的 N７ 甲基化 ）、肼（胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置开环）和哌啶（从修饰甲基处断裂核苷酸 链）。
四种终止物必须在4个PCR管中分别进行反应，即每管加1种 ddNTP DNA聚合酶Ⅰ，单链DNA模板，引物 ，四种dNTP（其 中一种为同位素标记），还有少量的ddNTP。
+ddATP
+ddCTP
每管均有正常的 dNTP，而ddNTP 约为dNTP浓度的 100-5000倍，这 样对于每个反应 管能形成一系列 以同个ddNTP为 3’端结尾的长 短不一片段的混 合物。 一般来说，测 序产物的平均 链长取决于 ddNTP与dNTP 的比例，比例 高时，得到较 短的产物；
标记终止物
四种混合物可以在一个PCR管中进行反应，当 然也可跑一道电泳。
只需一道电泳检测
荧光检测探头
讨论
Sanger法的改进
Sanger测序反应与PCR的差异

测序只用一条引物，PCR需要两条引物
测序反应需要加入dNTP和 ddNTP,PCR反应只需 dNTP


测序产物线性增长，PCR产物指数增长
1、 双脱氧链终止法
1977年Sanger等提出了“终止 法”。 这是一种利用双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP），将延伸的DNA链特 异性终止的技术。
互补链合成过程
ddNTP可以当作正常碱基参与复制，但一 旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。
分别利用4个反应体系进行测序反应，寡核苷酸链分别终 止于不同位置的A、G、C或T碱基
化学修饰法的待测 DNA片段有的是双链，有的是单
链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先
对待测DNA 片段作末端标记，使其末端(5′端或者
是3′端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必
须使其形成末端标记的单链。
对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲 酸对特定的碱基进行化学修饰； 第二步是利用哌啶使DNA链在修饰位点断裂。
反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点
G G+A C+T C
硫酸二甲酯 甲酸 肼 肼（加盐）
鸟嘌呤甲基化 脱嘌呤作用 嘧啶开环 胞嘧啶开环
哌啶 哌啶 哌啶 哌啶
G G和 A C和T C
DMS（硫酸二甲酯）可以使 腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟 嘌呤 G 的 N７ 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中 性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G 。 甲酸具有脱嘌呤作用。DNA链在脱嘌呤位点(G和A)发生断裂。

DNA聚合酶
Biblioteka 单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物（由20-23个 碱基构成，Tm=60-68℃）

Mg2+ 4种dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)
经典测序步骤:
1.模板与引物杂交
2.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸 的聚合链
在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只 有一个碱基被修饰(而不是全部被修饰 )，随后进行的断裂反 应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱 基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同 标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的 片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。
核酸序列分析与DNA计算
朱德裕 2013年11月8日
主要内容
一、DNA序列分析 二、大片段DNA测序策略
三、RNA序列分析
四、DNA计算
一、DNA序列分析
DNA 的测序是分子生物学研究中非常
重要和关键的内容。对DNA一级结构的
研究，有助于探索基因结构与功能、 基因与疾病关系，进而推动生命科学
研究获得质的飞跃。测定基因组的全
+ddGTP
+ddTTP
电泳和显影
将制得的四管里的混合物全部平行地点加在变性凝胶板上 进行电泳，各个组分将按其链长的不同得到分离。
四管反应，四道电泳
Sanger法整
体示意图
该法充分利用DNA复制的生物学特性, 通过DNA复制来识别 4种碱基的方法,进行DNA序列测定,
双脱氧终止法测序反应体系包括：
测序反应产物是长度相差一个碱基的一系列 多核苷酸片段， PCR产物是长度相同的一种片 段
Maxam-Gilbert化学降解法
几 乎 与 双 脱 氧 链 终 止 法 建 立 的 同 时 ， Maxam 和 Gilbert于1977年建立了一种以化学修饰为基础的DNA序 列分析法，称为Maxam-Gilbert（马克萨姆· 吉尔伯特 ） 化学降解法。
3.电泳 ACGT次序 高压电泳
4.放射自显影得到直读图象
测序反应的种类
（1）同位素标记 （2）荧光标记，又分为引物标记法(Dye primer reactions)和终止物标记法(Dye terminator reactions)两类。
标记引物
电泳
四色荧光标记在引物上，取代了放射性同位素，但还需分 四管反应，反应后可以混合成一管跑电泳。
Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂
肼
硫酸二甲酯
硫酸二甲酯主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键 断裂 。而肼可与嘧啶环反应，释放出嘧啶碱基，然后经哌啶 处理，将核苷酸架链打断。在酸的作用下DNA 链上的嘌呤上 的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落，然后发生断裂。
化学降解法与Sanger法一样，常用四个反应：G反应；A+G 反应；T+C反应和C反应。
部核苷酸序列、阅读和分析全部遗传 信 息 ，正 是人 类 基因 组计 划 （ human genome project, HGP) 的最主要目标 之一。
DNA测序的基本方法
1、双脱氧链终止法（Sanger法、酶促法） 2、化学降解法（ Maxam-Gilbert 法） 3、自动测序法 4、其它方法