生化实验4 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

南京大学医学系实验报告

题目：醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

姓名：彭睿学号：171230511 日期：2019年4月12日

(一)实验目的：

掌握利用醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和方法，掌握灰度分析技术。

(二)实验试剂：

pH8.6的缓冲液、氨基黑10B染色液、

漂洗液（95%乙醇45ml，冰乙酸5ml，蒸馏水50ml）、

透明液（冰乙酸25ml，无水乙醇75ml）、

浸出液（0.4mol/L NaOH溶液）、人血清。

(三)实验材料：

载玻片、点样玻片、滤纸、培养皿、

醋酸纤维薄膜、电吹风、量筒、

电泳槽、电泳仪。

(四)实验原理：

1. 蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，

在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中的移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离；

2. 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质

由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（如下表），在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于

7.0，所以在缓冲液（pH = 8.6）中，它们都可电离成负离子，在电场中向阳

极移动；

带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量，也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量；

4. 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、

妊娠等都可使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β-球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。

(五)实验步骤：

1.电泳装置准备：向电泳槽两侧分别加入等量的适量缓冲液；将双层纱布

放在电泳槽的搁架上，使纱布浸润并平贴。

2.醋酸纤维薄膜的点样前准备：取醋酸纤维薄膜一条，浸入缓冲液中，完

全浸透后，用镊子取出，使无光泽的一面朝上平放在滤纸上，再用另一张滤纸吸去多余的缓冲液。

3.点样：用玻璃棒蘸取少量血清，均匀涂抹在载玻片一端的截面上，然后

轻轻点样在距离纤维薄膜一端1.5cm处。

4.电泳：将点样完毕的薄膜平贴在搁架上的纱布上，点样面朝下，点样端

为阴极，接通电源，电压100-110v，通电1h。

5.染色与漂洗：电泳完毕，将薄膜浸在染色液中5min，取出，用漂洗液漂

至背景无色，再放置在蒸馏水中。

6.透明：用吹风机将薄膜吹干，浸入透明液，取出后平贴在干燥玻璃片上，

吹干即可得到背景透明的电泳图谱，可长期保存。

(六)注意事项：

1.和教材使用的巴比妥-巴比妥钠缓冲液相比，本次实验使用的缓冲液分离

度差一些，基本上可以分出4条带。

2.薄膜在润湿后难以分辨正反，点样前准备时，应该记住正反面，在完全浸

透后直接取出，进行下一步处理，以免混淆；薄膜应避免长时间暴露于空气中，缓冲液会迅速挥发，需要重新浸透。

3.点样时注意均匀点样，更不能重复点样，局部点样量太多会造成条带的边

界不清晰，电泳后形成半月形结构。

4.漂洗液、透明液有挥发性物质，配好后应该用保鲜膜封住。

(七)结果讨论：

1.制片结果如下：

可见四条条带，较为清晰，白蛋白颜色较深，可能是点样过多，制片无气泡。

2.灰度分析如下（ImageJ）：

3.各组分含量为：

白蛋白：58.9%

α-球蛋白：3.2%

β-球蛋白：7.7%

γ-球蛋白：29.2%

各组分正常值为：白蛋白含量61.2%~74.5%，α、β-球蛋白含量11.2%~22%（α-球蛋白含量约6%~14%，β-球蛋白含量约6.5%~12%），γ-球蛋白含量10.4%~20.6%。测量结果中，白蛋白偏低，α-球蛋白含量偏少，γ-球

蛋白含量偏多。

偏离原因分析：

(1)拍摄造成误差；

(2)imageJ可能不太好用；

(3)点样量太多，电泳时间不够，导致分离不彻底；