环境工程微生物学实验顾彦

4.清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲 洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必
须重复洗涤干净为止。
结果记录
第一个 第二个 第三个 第四个 第五个 中格 中格 中格 中格 中格
第一次 测定 第二次 测定 第三次 测定
平均
思考题
1.使用血球计数板应注意什么问题? 2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出 改进措施
湿热灭菌：高压蒸气灭菌法
高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。
注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待 温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排 出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。
5. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形 瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口 或瓶口上面造成污染(见图2－3)。分装量：固体培养基约为试 管高度的1／5，灭菌后制成斜面（图2－4）。分装入锥形瓶内 以不超过其容积的3/5为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为 宜．灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。
实验二 培养基的配制和灭菌
实验目的
1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。
实验原理
培养基是用人工的办法将多种营养物 质按微生物生长代谢的需要配制成的一种 营养基质。培养基中均应含有满足微生物 生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、 无机盐、生长因素以及某些特需的微量元 素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓 冲能力、氧化还原电位和渗透压。
解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成
分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并
适当补充因蒸发而损失的水量。
3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.2~7.4，用精密pH试纸对 照。
4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁 热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可 省略。
2.另取5支18mm×180mm的试管，分别装 9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。
无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的 材料。
四、灭菌
加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调 节至160℃并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度 降到50℃左右，才能将物品取出。
血球计数板的构造
血球计数板的计算方法
血球计数板上刻有一长宽各为1毫米的方形大格，其 体积为0.1mm3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为16 个中格，而每中格又分25个小格，每大格为16×25小格 =400小格，而另一种，则是每大格分为25个中格，而每中 格又分为16个小格，则每大格为25×16=400小格（计数板 上的标识为XB·K25）
棉塞的制作
。 包装培养皿和移液管等
2-1棉塞制作方法
2-2移液管灭菌前的包装
二、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、
NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶
操作步骤
1. 镜检计数室
对计数板进行镜检。若有污物，
则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。
2. 加样品
在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管
将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会
自动进入计数室，静置5分钟。
3. 计数
将血球计数板置于载物台上，先用低倍
镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 25个中格的 取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复 计2-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中 菌体的个数。
计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对 角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个 小格）的酵母菌数。如果使用25 格× 16格规格的计数室 除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80 个小方格)的酵母菌数。 (6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的 上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下方和右方线上的 酵母细胞)。
实验器材
(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10 ％NaOH溶液、l0％盐酸溶液、琼脂、水
(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、 1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、 试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、 烘箱。
实验步骤
一、玻璃器皿的洗涤和包装
清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。
计数公式
(1)16×25的血球计数板计算公式： 酵母细胞数／ml=（100小格内酵母细胞个数／
100）×400×10000×稀释倍数
(2)25x16的血球计数板计算公式： 酵母细胞数／ml=（80小格内酵母细胞个数／
80）×400×10000×稀释倍数
实验器材
显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻 片、吸管、吸水纸。
6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。
7. 灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力0.103MPa）培 养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可 使用。
图例
图2－3培养基分装
图2－4 斜面制作
三、稀释水的制备
1.取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸 馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、 菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包 扎，待灭菌。
环境工程微生物学实验
实验一 微生物细胞的计数
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目的要求
1.了解血球计数板的结构及计数 原理。
2、掌握使用血球计数板进行微 生物计数的方法。
实验原理
测定微生物数量方法很多，通常采用的有显 微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。
显微镜直接计数法
将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具 有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板， 于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的 方法。