碳纳米管_羟基磷灰石复合材料兔胫骨生物相容性研究_赵冬梅 (1)

25卷3期2006年6月中 国 生 物 医 学 工 程 学 报
Chinese Journal o f Biomedical Engineerin g Vol.25 No.3
June 2006
收稿日期:2005-11-20,修回日期:2006-04-27。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170269)。

*通讯作者。

E -mail:dongmei zhao663@sohu.c om
碳纳米管/羟基磷灰石复合材料兔胫骨生物相容性研究
赵冬梅
1*
刘中浩1 武士清1 李爱民2 赵敬杰1 王 彭3 孙康宁
2
1(山东大学第二医院骨科,济南 250033)2
(山东大学材料科学与工程学院,济南 250061)
3
(北京协和医院中心实验室,北京 100005)
摘 要:目的:探讨不同比例碳纳米管/羟基磷灰石纳米复合材料兔胫骨的生物相容性。

方法:将碳纳米管含量为2%和3%的碳纳米管/羟基磷灰石复合材料置入兔右侧胫骨的缺损处,在1周~12周分别进行x 线检查、组织学检查及分子生物学分析。

结果:不同碳纳米管含量的复合材料均能诱导成骨,无排斥反应。

X 线片、组织学检查、分子生物学检查均无明显差别。

结论:碳纳米管/羟基磷灰石材料有良好的骨相容性。

关键词:碳纳米管;羟基磷灰石;复合材料;胫骨;生物相容性
Biocompatibility of C arbon Nanotubes P Hydroxyapitite Composite with Tibia of Rabbit
Z HAO Dong -Mei
1*
LIU Zhong -Hao 1 WU Sh-i Qing 1 LI A-i Min 2 Z HAO Jing -Jie 1 WANG Pe ng 3 SUN Kang -Ning
2
1
(De pa rtmen t o f O rtho pe dics ,Th e Secon d Hospital o f Shan don g Un ive rsity ,Jina n 250033)
2
(Shool o f Ma te ria l Scie nce an d En gine erin g ,Sh an dong U ni versit y ,Jin an 250061)
3
(Pekin g Un ion Medic al Colleg e Hospital ,Be ijin g 100005)
Abstract :Objective :To study the biocompatibility of carbon nanotubes P hydroxyapitite c omposite (CN Ts P HAP).M ethods :X -ray,histology observation and molecular biology were ca rried out for 1~12weeks after CNTs P HAP was implanted into the right tibia of rabbit.Resu lt :The composites c ould induce ossification without rejection.There was no t significant difference between the co mposites.Con clusion :CNTs P HAP have acc eptable bioc ompa t ibility.Key words :ca rbon nanotubes;hydroxyapatite;c omposi te;t ibia;bioc ompatibility
中图分类号 R318 文献标识码 A 文章编号0258-8021(2006)03-0342-04
引言
羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP),作为修复骨缺损的常用材料,存在强度低、韧性差的缺点,限制了其在骨外科领域的广泛应用。

碳纳米管具有优异的力学和电学性能,已被用来增强各种材料,包括高分子材料、金属材料和陶瓷材料[1-3]。

本研究分析认为,将碳纳米管与羟基磷灰石复合,有可能发挥碳纳米管在力学性能方面的优势,同时可使复合材料具有良好的生物相容性。

本研究将碳纳米管/羟基磷灰石复合材料(Carbon Nanotubes P Hydroxyapitite,C NTs P HAP)植入兔胫骨内,通过行
X 线片检查、组织学观察以及分子生物学检测,评价了该复合材料的生物相容性,为其应用于临床修复骨缺损提供实验依据。

1 材料与方法
111 材料
本实验中所使用的CNTs/HAP 由山东大学材料
科学与工程学院制备,其成分比例、制备方法、理化特性见表1。

复合材料用高压灭菌。

健康雄性新西兰大白兔30只,体重215kg ?100kg,月龄2月,由山东大学动物实验中心提供。

表1实验中所用C NTs P HA P的组成和力学性能
样品编号复合材料中碳纳米管
含量P wt%
烧结温度P
e
保温时间P
h
气氛
弯曲强度P
MPa
断裂韧性P
MPa#m1P2
1311002真空6611121401 2211003氩气6418501746
112动物模型的建立
以氯胺酮(35mg/kg)腹腔注射麻醉,双后肢常规脱毛,消毒铺巾,显露双侧胫骨上段,以直径4mm骨钻钻孔,保留对侧骨皮质,造成015cm@ 015cm大小的圆形骨洞,两洞间距2cm,将严格消毒后的圆柱状的复合材料分别置入双侧胫骨骨洞处,使端端紧密嵌合。

术后每只兔每日给予青霉素20万单位肌肉注射预防感染,连续2d。

2观察指标
211X线检查
分别于术后3周、5周、7周、9周、12周摄双后肢正侧位X线片,观察复合材料和骨组织的界面情况。

212组织学检查
分别于术后1周、3周、5周、7周、9周、12周断头处死动物,取材,常规10%福尔马林液固定,脱钙,石蜡包埋,连续切片,HE染色,光镜下观察。

213分子生物学分析
将所得到的动物样品应用R T-PC R的方法对其进行评价。

选择血管内皮生长因子(VEGF)为分析对象,合成特定的引物与内参照物,提取所得组织的总RNA,然后利用标准试剂盒对所得RNA进行逆转录。

利用逆转录PCR技术和设定的两对引物,分别得到VEGF153bp和L19200bp的产物,同时测定各样本,为了准确反映VE GF的表达程序,应用VEGF与L19表达的比值来去除混杂因素,PCR 的阳性结果以肉眼能见其电泳扩增为判断标准。

3结果
311X线检查结果
术后前3周,复合材料与骨组织之间界面清晰,第5周结合较为紧密,界面模糊。

第7周材料周围可见骨痂形成。

第9周可见大量骨痂形成。

第12周复合材料与骨组织之间界面消失,完全被硬骨痂覆盖。

未见骨组织吸收、坏死。

312组织学检查结果
图1是复合材料植入后不同时间内的组织学检测结果。

由图可见,术后3周,材料周围有肉芽组织形成,间质疏松水肿,有异物巨细胞存在,血管充血扩张,但仍有不少炎性细胞。

术后5周,有成纤维细胞分布,并可见有大量纤维组织包绕植入物,炎细胞数量减少,炎症反应减弱,并有纤维母细胞生成。

术后12周,材料周围可见晚期骨痂,材料界面上少有细胞存在,大部分区域与类骨质直接接触。

周围界限不清,靠近新生骨部分可见哈佛氏系统。

313RT-PCR结果
目的基因与L19都为1条条带,且条带比较明亮。

用数字图像分析系统进行灰度扫描,发现不同时间所取的各样品VEGF mRNA与L19mRNA的含量在复合材料植入后3周内表达水平较高,而从3周之后开始则缓慢下降,至12周时样品中的VEGF 表达水平已很低。

见图2。

4讨论
骨科植入物的表面经常会被成纤维细胞所形成的纤维组织所包裹,造成伤处不愈合和移植物的松脱。

所以对骨组织而言,使用碳纳米管含量较高的复合材料,能促进组织再生,同时也能显著地抑制对植入设备产生不利影响的胶质瘢痕和纤维组织的形成[4]。

本研究对兔骨组织的定期X光照片和病理学检查研究结果表明,复合材料与骨组织的界面结合良好,植入5周后,材料与界面之间的空隙已很小,9周时已形成硬骨痂,12周后材料与界面之间已基本没有空隙,而是被大量硬骨痂覆盖,没有引起骨组织的变性及坏死。

上述结果说明,这种复合材料具有良好的生物相容性。

此外, Lewandrowski等[5]用纳米羟基磷灰石和小颗粒羟基磷灰石材料修复鼠胫骨缺损时,也发现术后3周时,纳米羟基磷灰石材料的生物相容性和骨融合情况较其它实验组好,骨形成更明显。

分析认为,材料的纳米结构特征可能在一定程度上改善了材料自身与骨组织之间的生物相容性,更合理地为骨细胞生长提供传导通道,促使骨生长加速。

术后12周时,材料周围界限不清,未见明显的骨坏死,表明不同比例材料均能引起骨愈合,生物相容性好。

分子生物学结果显示,在材料植入的不同阶段,其周围骨组织中VEGF基因表达的程度不同,在3周以前,由于伴随着材料对种植部位的刺激,种植部
343
3期赵冬梅等:碳纳米管/羟基磷灰石复合材料兔胫骨生物相容性研究
图1复合材料植入兔胫骨术后组织学检查结果:其中(a)、(c)、(e)分别为1号材料植入后第三周、第五周和第十二
周的组织学检查结果;(b)、(d)、(f)分别为2号材料第三周、
第五周和第十二周的组织学检查结果
图2材料植入兔胫骨术后RT-PC R结果,其中两位数的前一位代表材料编号,后一位代表术后周数
位的局部出血,炎细胞反应、肉芽组织的产生等过程,使种植部位血供相对减少,氧分压降低,低氧强烈诱导VEGF的产生。

其后期表达水平较低,主要是因为随着新生血管的不断增多,损伤部位的低氧状况逐步得到改善,细胞分泌的VE GF量逐渐减少,成骨细胞的后期表达也趋于稳定。

不同碳纳米管含量的复合材料在1周、3周时的表达水平相差不大,而在第5周时,材料的表达水平开始下降,至第12周时,已基本无VEGF表达,这表明复合材料植入骨中之后都没有去除VEGF,而是刺激VEGF的产生,这一点对组织的修复是有利的,从另一方面显示出该复合材料具有良好的生物相容性,这一结果与组织学观察的结果也相一致。

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(上接第341页)
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