第四章 菌种选育的一般流程
第4章菌种选育.ppt.Convertor
第4章菌种选育.ppt.Convertor第四章菌种选育1菌种选育应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。
菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。
菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。
2自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种（详后）3一、自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。
自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。
一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）4自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高5制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：6自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。
自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。
二、诱变育种诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。
诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。
目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。
以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为40U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。
菌种的选育
一、菌种分离的一般过程:土样的采取→土样预处理→富集培养→菌种初筛-----菌种复筛----性能鉴定--菌种保藏目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。
二、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
三、菌落的选出从产物角度出发：在培养时以产物的形成有目的的设计培养基，利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素从形态的角度：菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。
如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。
第四节菌株选育、分子改造目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。
方法：基因突变，自然选育，诱变育种，基因的直接进化，基因重组。
自然选育定义：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。
由于促使变异产生的环境因素的影响较溺，不可能产生大的变异，也就难以依赖自然选育来获得高产突变株。
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
自然选育操作步骤：单细胞(孢子)悬液的制备-----平板分离-----挑选单菌落(注意形态的观察)-----发酵试验稀释涂布平板法步骤： 1、倒平板：牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌），高氏I号培养基（培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基），查氏培养基（培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基）冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。
2.制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。
取1ml 加入盛有9ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。
3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.2ml对号放入平板上，用玻棒涂布。
4、培养：高氏I号和查氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37℃培养1-2days。
《菌种的选育》PPT课件
1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。
2.抗性菌株的产量实验 3.真正抗性和溶原性的区别
2.5.3 噬菌体的防治 噬菌体的危害：引起发酵液变稀,
引起菌丝体变形,消解,发酵终产物积累 停止甚至下降. 怎样防治? 1.正确判断 2.普及有关噬菌体的知识 3.选育抗噬菌体菌株 4.消灭噬菌体 5.收集和保存噬菌体
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂 生物诱变剂 噬菌体 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见 (p38) 整个流程主要包括:诱变和筛选. 诱变育种中的几个注意问题 1.出发菌株的选择
出发菌株标准:产量高、对诱变剂的 敏感性大、变异幅度大。
待处理的菌悬液应考虑微生物的生理 状态、悬液的均一性和环境条件。一般要 求菌体处于对数生长期，并采取一定的措 施促使细胞处于同步生长,这样有利于变 异率提高得到很好的重现性。
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
自然选育在工业生产上的意义
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变
营养缺陷性:微生物经诱变剂处理, 由于基因突变,失去了合成某种物质 的能力,不能在基本培养基上生长需 要补加一定种类的有机物质后才能 生长.
2.6.1 细菌的杂交育种
A-B+Lac-SMrT1s
A+B-Lac+SMsT1r
A-B+Lac-SMrT1s A-B-Lac+SMsT1r A+B+Lac+SMrT1r A+B+Lac+SMsT1s
微生物的菌种选育
理想的工业发酵菌种应符合以下要求：⑴遗传性状稳定⑵生长速度快，不易被噬菌体等污染⑶目标产物的产量尽可能接近理论转化率⑷目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离⑸尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量并且有利于产物分离⑹培养基成分简单、来源广、价格低廉⑺对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感⑻对溶氧的要求低，便于培养以及降低能耗一、从自然界获得新菌种的步骤分离微生物新种的具体步骤大体可分为采样、增殖、纯化、性能测定。
采样菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园数根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。
豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。
各种水体也是工业微生物菌种的重要来源，许多具有光合作用能力的微生物以及兼性或专性厌氧微生物都能从各种水体中筛选得到。
增殖才采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，常以投其所好和取其所抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。
纯化常用的菌种纯化方法很多，大体可将它们分为两个层次，一个层次较粗放，一般只能达到“菌落纯”的水平，从“种”的水平来说是纯的，其方法有划线分离法，涂布分离法和稀释分离法。
另一层次是较为精细的单细胞或单孢子分离法，它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平。
具体操作方法很多，最简便的方法是利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微镜操作装置进行单细胞挑取。
性能测定菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。
二、基因突变和微生物菌种选育基因是在生物体内具有自主复制能力的遗传功能单位，是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段，每个基因约有1000个碱基对。
基因是合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是指DNA序列）。
菌种选育
基因工程育种
随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录 表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去 干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后 代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那 种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由 重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 基因工程是生物 工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 所谓基因工程 （genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体 细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物 的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接 起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的 复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
步骤
自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样 筛选的菌种采集的对象以土壤为主， 也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物， 故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养 由于采集样品 中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数 量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中 本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种 环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物 细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后， 可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法 在溶液中再加 入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶 液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察 初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关 性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生菌来说，选出抑菌圈大的菌落；对于蛋白 酶产生菌来说，选出透明圈大的菌落。此法快速、简便，结果直观性强。缺点是培养皿的培养条件与三角瓶、发 酵罐的培养条件相差大，两者结果常不一致。
第四章 菌种的选育和保存
3、采用单核细胞处理
诱变剂所处理的细胞中的细胞核愈少愈好，最好 是处理单核细胞（用玻璃珠打散）。如处理霉菌 或放线菌，则尽量采用孢子进行处理。如是芽孢 杆菌，则处理芽孢。
4、注意微生物的生理状态
一般对数期的细菌对诱变最为敏感。让霉菌或放 线菌的分生孢子稍稍萌发，可以提高诱变效果。
5、适宜的诱变方法
2). 嵌合剂
常用有哑啶类染料、溴乙锭、ICR等化合物。能 引起移码突变。
3). 碱基类似物
分子结构与DNA上的碱基相似的化合物称为碱基 类似物。如5-溴尿嘧啶（5-BU）、6-氨基嘌呤等 。这些化合物干扰了DNA分子内酮式与烯醇式的 平衡。它们掺入DNA分子，使其出现烯醇的比例 增加。分别形成AT向GC和GC向AT的转换。
2、引入抗性基因和调节基因，增加抗生素单位 产量
许多抗生素生物合成基因经常与菌种对自身抗生 素耐药基因连锁存在，因此可利用高拷贝质粒的 基因剂量，提高菌种对自身抗生素的抗性，可提 高抗生素产量。
另外，调节基因在抗生素的生物合成中也起很重 要的作用，增加正调节基因的拷贝数也能大幅度 地提高次级代谢物的合成能力。
可将Vgb通过质粒转入变青链霉菌和天蓝色链霉 菌中,在限氧条件下不仅使菌体生长量增加,还使 其放线紫红素产量提高。也可将Vgb引入产黄顶 头孢霉菌及产黄青霉菌中,限氧时VHb在前者的 表达量较高,而且头孢菌素C的产量比对照菌株提 高5倍。 但这些实验仅在“限氧”这个特定条件下进行， 而在工业发酵上，它的表达量很低，没有显示出 产量增加优势，还有待进一步深入研究。
特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处 理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异 的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的 几率。
物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中 子、β射线、超声波、激光
菌种选育技术
诱 变 筛 选 的 典 型 流 程
出发菌株 纯化
斜面培养 完全培养基同步培养
离心洗涤 玻璃珠振荡分散
过滤
单细胞或孢子悬浮液 自然分离（对照液）活菌计数
诱变处理
平板分离
形态变异并计算其变异率
挑取单菌落传种斜面
摇瓶初筛
对照组比较
挑出高产斜面
留种保藏斜面
传种斜面
摇瓶复筛
对照组比较
挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察
♫ ① 菌种在有限的发酵过程中生长繁殖快和
代谢能力强。 周期短
产率高
高产菌株
生长快速
♫ ② 菌种遗传特性稳定，不易变异退化，且
菌种所要求的工艺控制比较粗放，易于控制， 有利于发酵生产运行和产品质量的稳定。
遗传稳定
工艺粗放
自发突变
回复突变
变异
例如
多个遗传标记的菌株 基因工程菌株
♫ ③ 发酵过程中产生的副产物少，不但有利
一般处理真菌的孢子或酵母时， 其菌悬液的浓度大约为106个／mL。
细菌和放线菌的孢子的浓度大约 为108个／mL。
前培养
诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等 碱基或酵母膏的培养基中培养20～60 min， 再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。
诱变因素及其剂量的选择
凡是能引起生物体遗传物质发生 突然或根本改变的物质。
♫ 如果预先不了解某种生产菌的具体来源，
一般可从土壤中分离。
酵母
霉菌
♫ 由于酵母类、霉菌类对碳水化合物的需要
量比较多，一般又喜欢偏酸性环境，故在 植物花朵、瓜果种子及腐殖质含量高的土 壤等上面比较多。
增殖培养
♫ 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有
食品微生物学 第四章微生物遗传与菌种选育 第二节微生物的菌种选育
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.1 诱变育种的步骤:
确定出发菌 ↓
菌种的纯化选优 ↓出发菌株性能测定
同步培养 ↓
制备单细胞（单孢子）悬液 ↓
诱变剂选择与诱变剂量的预试验 ↓
诱变处理 ↓
平板分离 ↓计形态变异菌落数、↓
重复筛选 ↓摇瓶发酵试验
选出突变株进行生产试验
如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求， 可以留之作为菌种选育的出发菌株。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2 微生物的诱变育种
诱变育种是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群， 促进其突变率在同提高，再从中筛选出少数符合育种目的的 突变株。
诱变育种的主要手段是以合适的诱变剂处理大量而分散 的微生物细胞，在引起大部分细胞死亡的同时，使存活细胞 的突变率迅速提高，再设计既简便、快速又高效的筛选方法， 进而淘汰负突变并把正突变中效果最好的优良菌株挑选出来。
微生物遗传与菌种选育
4.2.1.4 纯种培养 经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落
形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定， 对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。 4.2.1.5 生产性能测定
从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛 选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作 为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌 种。
微生物遗传与菌种选育
4.2.2.2 营养缺陷型突变株的筛选
在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有 着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的 缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱 基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养 物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野 生菌株。
菌种选育的一般流程ppt课件
选育结果
通过基因工程育种和代 谢工程育种等方法，成 功选育出高产谷氨酸的 菌株，谷氨酸的产量和 质量得到显著提高。
实例三：柠檬酸高产菌株的选育
基因工程育种的方法
01
02
03
农杆菌转化法
利用农杆菌感染植物细胞 ，将目的基因导入植物基 因组中，实现遗传转化。
基因枪法
利用基因枪将带有目的基 因的金属微粒直接射入受 体细胞或组织，实现基因 转移。
花粉管通道法
在植物授粉后，利用花粉 管作为通道，将外源DNA 导入受精卵细胞，实现遗 传转化。
基因工程育种的优缺点
杂交育种的优缺点
遗传不稳定
杂交后代的遗传物质来自两个亲 本，容易出现分离和不稳定现象
。
技术难度高
杂交育种需要较高的技术水平和 精细的操作，对实验条件和操作
人员要求较高。
难以预测结果
由于基因互作和环境因素的影响 ，杂交后代的表型难以准确预测
。
06
菌种选育实例分析
实例一：青霉素高产菌株的选育
1 2 3
自然选育的优缺点
优点
简单易行，不需要复杂的仪器设 备；可以筛选出适应特定环境的 优良菌种。
缺点
筛选过程漫长且效率低下；受环 境因素影响大，结果不稳定；无 法对微生物的遗传物质进行精确 改造。
03
诱变育种
诱变育种的原理
80%
基因突变
利用物理、化学或生物因素诱导 生物体发生基因突变，从而产生 新的遗传性状。
打破物种界限
基因工程育种可以克服远缘杂交不亲和的障碍，实现不同物种间基因的转移和 重组。
第四章 菌种选育的一般流程
４、蛋白质翻 译提前终止或 表达出的蛋白 质没有功能；
１、不改变密 码子的功能， 蛋白质的功能 不变；
（二） 遗传物 质改变 的效果
５、增加了新 的蛋白质；
１、遗传型获得改变； ２、改变的遗传物质能够得到表达； ３、没有原始蛋白质的干扰； ４、新表型不是致死表型。
1、自然选择 2、人工创造条件，使各种表型出现；
２、出发菌株的选择
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1、是纯种； ２、稳定性好； ３、生长快； ４、能在短时间内积累产物； ５、具有一定的抗污染能力； ６、对诱变剂敏感。
１、突变；
２、杂交及遗传物质重组；
３、分子转移；
1、自发突变与育种
（1）从生产中选育 （2）定向培养优良菌种
1、选择 合适的出 发菌株
2、诱变育种
（2）平皿快速检测法 A、纸片培养显色法 B、变色圈法 C、透明圈法 D、生长圈法 E、抑制圈法 （3）摇瓶培养法 常用于复筛 是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中， 振荡培养，然后对培养液进行分析测定。
使变异基因纯化
六、保种
3、人工选择条件下，只有符合目标的表型出现； 4、人工创造条件，部分表型出现；
（1）从菌体形态变异分析
（2）平皿快速检测法
（3）摇瓶培养法
（1） 从菌体形态变异分析 有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性。 如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现菌落的 棕红色变深者往往产量有所提高。
第四章 菌种选育的一般流程
出发菌株 出发菌株
遗传学改变产生遗传多样性库 遗传学改变产生遗传多样性库
表型多样性库 表型多样性库 筛选 筛选 未获得有益改变 未获得有益改变
菌种的选育与保藏
微生物菌种选育与保藏本章知识概要第一节菌种分离与筛选第二节菌种选育第三节菌种保藏第一节菌种分离与筛选1、采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。
是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）②采样方法：选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、C：添加特殊抑制剂---抗生素3、纯种分离：富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养粗放型：菌落纯精细型：菌种纯划线分离法A：粗放型涂布分离法稀释分离法平板划线分离法：接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。
另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
菌种选育方法ppt课件
40
工程菌不稳定性的原因
工程菌稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理 和遗传性及环境条件等因素有关。
质粒本身的分子结构：引起工程菌不稳定常常是由于稳定区 受到影响。另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主 染色体有部分同源等都会造成质粒的不稳定
B．抗生素依赖变异法 即通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖
性突变株，只有存该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含 有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆 菌就能在不含抗生素的培养基中生长。
C．营养缺陷型法 与上述抗生素依赖变异法相类似。其原理是通过
诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到 重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存 活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。
35
重组子筛选-蓝白筛选
36
DNA重组－重组子的筛选及表达菌株的转化
重组质粒的提取 表达菌株感受态细胞的制备 转化及复苏
37
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达Leabharlann SDS－PAGE 免疫分析
细胞 破碎
蛋白 分离
培养
滤
凝胶
免疫
纸
分析
NC 膜
＋
转膜 38
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、 乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落 刺激因子GM-CSF等，成本大大下降
45
菌种退化原因
基因突变 自发负突变 回复突变：生产株成为野生型
分离现象：多核（或单核）但是DNA双链之一发生 突变，随着传代，核发生分离，导致突变基因和未 突变基因的分离。
《菌种选育》PPT课件
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
（1）所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、
溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节
突变株）
（5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生
二、重要工业微生物的分离方法
•施加选择压力的分离方法：
1 、富集液体培养 ：指能增加混合菌群中所 需菌株的数量的一种技术。
要领： 给混合菌群提供一些有利于所需菌株 生长或不利于其他菌群生长的条件。
e.g. 供给特殊的基质或加入某些抑制剂。
❖ 注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会 改变培养基的性质，从而改变选择压力，使 其他微生物生长。
❖ 收集在腐烂的稻草和其它植物材料中的嗜热放线菌孢子可在 空气搅动下进行，并可用简单的沉淀室收集孢子。然后，用 取样器将空气撞击在培养基的平板上，这样可以减少分离平 板中的细菌数目。
❖ 在分离前添加一些固体基质(如把几种基质加在土壤中)或洒些 可溶性养分来强化培养基。
❖ 所谓诱饵技术是将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌 落长成后再铺平板。有人曾广泛使用石腊棒技术来分离诺卡 氏菌，从土壤中分离耐酸放线菌。近来,用花粉诱饵从土壤中 分离出13株小瓶菌，其中有些新种或亚种。
固体培养基四区划法接种法介绍如下：
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。 此为第一菌区 。
优良菌种的选育
１、原核表达系统
原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因
优点：简单易行，可与生产同步进行。 优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低， 次分裂。 缺点：频率低，10-8—10-9 /次分裂。 次分裂
二、诱变选育
诱导微生物发生突变进行的菌种选育， 诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包 诱变和筛选两个步骤 两个步骤。 括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。 原理：染色体畸变；基因突变。
④物敏突变： 物敏突变：
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 柠檬酸积累。 少，柠檬酸积累。
三、杂交育种
长期诱变会使菌种生活能力下降。 长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组， 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种 细菌的杂交育种
应用：解决了一些药物或材料来源困难， 应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复
杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。 产生了巨大的经济和社会效益。 工业生产的意义： 工业生产的意义： 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 产物的生物活性； 产物分离纯化。 产物的生物活性； 产物分离纯化。 （一）基因表达系统 从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达 最重要的是目的基因的高效表达。 从育种的角度考虑 最重要的是目的基因的高效表达。 原核表达系统； 真核表达系统 真核表达系统． １.原核表达系统；２.真核表达系统． 原核表达系统
食用菌菌种选育的一般方法
食用菌菌种选育的一般方法导言3-1自然选育定义：自然突变的结果：自然选育的特点：简单易行，可以纯化菌种，防止菌种退化，稳定产量。
但自然选育的效率低，应该经常跟诱变选育交替使用，提高育种效率。
自然选育的一般程序：3-2诱变选育导言3-2-1诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变，突变包括染色体畸变和基因突变两大类。
染色体畸变指的是，染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。
基因突变指的是，DNA中的碱基发生变化，即点突变。
过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。
表3-1所示。
3-2-2诱变育种的基本方式导言3-2-2-1出发菌株的选择进行诱变的出发菌株的性能，对提高诱变效果和效率十分重要。
选择出发诱变菌株的注意事项：诱变育种的程序：3-2-2-2诱变剂的使用方法|------单一诱变剂处理：对野生菌株处理有效。
诱变方法||------复合诱变剂处理：对经过多次诱变处理的老菌株。
复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理|----两种以上诱变剂先后分别处理|----两种以上诱变剂同时或多次处理举例：青霉菌的选育。
3-2-2-3诱变剂的剂量选择诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有关。
因此，可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。
关系：诱变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定程度后，反而下降。
近年来处理剂量控制在致死率70-80%。
高剂量诱变的好处：A形成较纯的菌株。
(引起一些细胞核变异，同时引起另外一些细胞核被破坏，细胞死亡。
)B促使变异菌株稳定，不易产生回复突变。
（高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤。
）3-2-3突变菌株的筛选3-2-3-1营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值。
已经广泛应用在氨基酸、核苷酸生产中。
在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。
菌种选育方法
SDS－PAGE 免疫分析 细胞 破碎 培养 蛋白 分离
滤 纸
凝胶
免疫 分析
NC 膜
＋
转膜
38
工程菌的稳定性问题
由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、 乙肝表面抗原、人促红细胞生成素(EPO)、重组激酶、集落 刺激因子GM-CSF等，成本大大下降
研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出 不稳定性，因而工程菌稳定性的解决已日益受到重视，并成 为基因工程这一高技术成就转变为生产力的关键之一。
保持菌株不变异，不退化。
45
菌种退化原因
基因突变
自发负突变 回复突变：生产株成为野生型
分离现象：多核（或单核）但是DNA双链之一发生
突变，随着传代，核发生分离，导致突变基因和未
突变基因的分离。
46
菌种保藏的原理和方法
原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点， 人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽 量降低，以减少其变异。
生物工艺学
2 菌种选育(4)
1
主要内容
菌种选育
自然选育 诱变育种
抗噬菌体菌株的选育
杂交育种
原生质体融合技术
DNA重组技术 菌种保藏
2
2.2.6 DNA重组技术
概述
基因工程（genetic engineering） ：在生物体外，通过对DNA分 子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和 重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在 受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物（70年代，基于 DNA限制新性内切酶、DNA连接酶的发现） 。
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出出发发菌菌株株
遗遗传传学学改改变变产产生生遗遗传传多多样样性性库库
表表型型多多样样性性库库
筛选筛选
未未获获得得有有益益改改变变
获获得得目目标标性性状状改改善善的的优优良良菌菌株株
一、出发菌株
１、来源
从菌种保藏机构购买 从自然界分离 从传统产品中分离 从相关科研机构索取
２、出发菌株的选择
高。
（2）平皿快速检测法
A、纸片培养显色法 B、变色圈法 C、透明圈法
D、生长圈法E、抑制Biblioteka 法（3）摇瓶培养法 常用于复筛
是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，
振荡培养，然后对培养液进行分析测定。
❖ 使变异基因纯化
六、保种
5、保藏和 扩大试验
4、筛选
2、制备待 处理的菌
悬液
3、诱变处 理
菌种的遗传研究背景 菌种的育种经历 菌种的生理代谢研究背景
三、使遗传型转变成表型
（一）基因型和表现型
1、一个微生物的基因是它所有基因的总和，即它的全套DNA。 2、一个微生物的表现型是微生物结构大分子的总和。由于结构大分子的合成、降 解最终都依赖于蛋白质，所以表现型最终都可简单认为是蛋白质的功能体现。 3、表现型是由基因型和后天环境共同决定的。
1、自然选择 2、人工创造条件，使各种表型出现； 3、人工选择条件下，只有符合目标的表型出现； 4、人工创造条件，部分表型出现；
❖ （1）从菌体形态变异分析 ❖ （2）平皿快速检测法 ❖ （3）摇瓶培养法
（1） 从菌体形态变异分析 有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性。 如在灰黄霉素产生菌荨麻青霉的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提
２、个别密码 子发生了改变， 但蛋白质的功
能不变；
３、密码子发 生了改变，使 蛋白质性质改
变；
４、蛋白质翻 译提前终止或 表达出的蛋白 质没有功能；
１、不改变密 码子的功能， 蛋白质的功能
不变；
（二） 遗传物 质改变 的效果
５、增加了新 的蛋白质；
１、遗传型获得改变； ２、改变的遗传物质能够得到表达； ３、没有原始蛋白质的干扰； ４、新表型不是致死表型。
❖ 1、是纯种； ❖ ２、稳定性好； ❖ ３、生长快； ❖ ４、能在短时间内积累产物； ❖ ５、具有一定的抗污染能力； ❖ ６、对诱变剂敏感。
１、突变； ２、杂交及遗传物质重组； ３、分子转移；
1、自发突变与育种
（1）从生产中选育 （2）定向培养优良菌种
1、选择合 适的出发
菌株
2、诱变育种
利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微 生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然 后简便、快速和高效地筛选少数符合育种目的 的突变株。 诱变育种的过程