T细胞亚群在乙肝病毒相关性肝癌患者中的变化及其临床意义

作者简介:廖钰霖,女,主管技师,主要从事临床检验㊁免疫方向研究.本文引用格式:廖钰霖,何淑娅,宋晓玉．T 细胞亚群在乙肝病毒相关性肝癌患者中的变化及其临床意义[J ]．国际检验医学杂志,２０１９,４０(３):３３８Ｇ３４１．论著 临床研究T 细胞亚群在乙肝病毒相关性肝癌患者中的变化及其临床意义廖钰霖,何淑娅,宋晓玉(四川省肿瘤医院检验科,四川成都６１００４１)㊀㊀摘㊀要:目的㊀探讨T 细胞亚群在乙肝病毒相关性原发性肝癌(H B V ＧP L C )患者中的表达变化及其对临床结局的影响程度.方法㊀原发性肝癌患者１３６例,依据是否存在H B V 感染分为H B V ＧP L C 组(７８例)和非H B V ＧP L C 组(５８例),采用流式细胞仪检测患者血清中C D ４＋T 细胞㊁C D ８＋T 细胞和T r e g 细胞百分比,随访患者６个月,依据生存和死亡情况将H B V ＧP L C 患者分为死亡组和存活组,采用二分类多因素L o gi s t i c 回归分析模型探讨影响H B V ＧP L C 患者临床结局的因子及其大小.结果㊀同非H B V ＧP L C 患者相比,H B V ＧP L C 患者T细胞亚群出现了显著失调,H B V ＧP L C 患者C D ４＋T 细胞和T r e g 细胞百分比明显增高(P ＜０．０５),而C D ８＋T 细胞百分比明显降低(P ＜０．０５).死亡组患者C D ４＋T 细胞和T r e g 细胞百分比明显高于存活组(P ＜０．０５),而C D ８＋T 细胞百分比明显低于存活组(P ＜０．０５).T 细胞亚群(C D ４＋T 和T r e g 细胞)均是H B V ＧP L C 患者不良临床结局的强风险因素,其O R 值分别为３．７６５和２．２３８(P ＜０．０５),而C D ８＋T 细胞可能是一个保护性因子,其O R 值为Ｇ３．５３７(P ＜０．０５).结论㊀H B V ＧP L C 患者中存在显著的T 细胞免疫功能失调,T 细胞亚群可能成为H B V ＧP L C 患者临床不良结局的预测因子.关键词:乙型肝炎病毒;㊀原发性肝癌;㊀细胞免疫;㊀T 细胞;㊀预测分析D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０３．０２０中图法分类号:R ４４６．６;R ７３５．７文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１９)０３Ｇ０３３８Ｇ０４文献标识码:AC h a n g e a n d i t s c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e o f T Ｇl y m p h o c yt e s u b s e t i n p a t i e n t sw i t h h e pa t i t i sBv i r u s Ｇa s s o c i a t e d l i v e r c a n c e r L I A OY u l i n ,H ES h u y a ,S O N GX i a o yu (D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y ,S i c h u a nC a n c e rH o s p i t a l ,C h e n gd u ,S i c h u a n ６１００４１,C h i n a )A b s t r a c t :O b je c t i v e ㊀T o a s s e s s t h e e x p r e s s i o n o fTc e l l s u b s e t i n p a t i e n t sw i t hh e p a t i t i s Bv i r u s Ｇa s s o c i a t e d p r i m a r yl i v e r c a n c e r (H B V ＧP L C )a n d i t s i n f l u e n c e o n t h e c l i n i c a l o u t c o m e ．M e t h o d s ㊀１３６c a s e sw i t hP L Cw e r e s e l e c t e d ,a n dd i v i d e d i n t oH B V ＧP L C g r o u p (７８c a s e s )a n dn o n ＧH B V ＧP L C g r o u p (５８c a s e s )a c c o r d i n g toH B V i n f e c t i o n ．T h e p e r c e n t a g e o f C D ４＋Tc e l l s ,C D ８＋Tc e l l s a n dT r e g c e l l s i n s e r u m w a s t e s t e db y f l o wc y t o m e t r y ．A f t e r ６m o n t h s o f f o l l o w Ｇu p ,H B V ＧP L C p a t i e n t sw e r e d i v i d e d i n t od e a t h g r o u p a n d s u r v i v a l g r o u p ．B i n a r y lo Ｇg i s t i c r e g r e s s i o na n a l y s i sw a s p e r f o r m e d t oe x p l o r e t h e f a c t o r a n dd e g r e ea f f e c t i n g cl i n i c a l o u t c o m eo fH B V ＧP L C p a t i e n t s ．R e s u l t s ㊀A s c o m p a r e dw i t hn o n ＧH B V ＧP L C g r o u p ,d y s r e gu a l t e dTc e l l s u b s e tw a so b s e r v e d i n t h eH B V ＧP L C g r o u p ,p e r c e n t a g e o f C D ４＋Tc e l l s a n dT r e g c e l l s i nH B V ＧP L C p a t i e n t sw a s h i gh e r (P ＜０．０５),w h i l eC D ８＋Tc e l l p e r c e n t a g ew a sd e c r e a s e d (P ＜０．０５)．T h e p e r c e n t a g eo fC D ４＋Tc e l l s a n dT r e g ce l l sw a s h i g h e r i nd e a t h g r o u p t h a n s u r v i v a l g r o u p (P ＜０．０５),b u tC D ８＋Tc e l l p e r c e n t a gew a s l o w e r t h a n t h a t o f s u r Ｇv i v a l g r o u p (P ＜０．０５)．T Ｇl y m p h o c y t e s u b s e t (C D ４＋Tc e l l s a n dT r e g c e l l s )w a s as t r o n g ri s kf a c t o r f o r a d Ｇv e r s e c l i n i c a l o u t c o m e o fH B V ＧP L C (O Rv a l u e sw e r e ３．７６５a n d ２．２３８,r e s p e c t i v e l y ,P ＜０．０５),b u t C D ８＋Tc e l l w a s a p r o t e c t i v e f a c t o r (O Rv a l u ew a s Ｇ３．５３７,P ＜０．０５)．C o n c l u s i o n ㊀O b v i o u sd ys f u n c t i o no fTc e l l u l a r i m Ｇm u n e f u n c t i o n e x i s t s i nH B V ＧP L C p a t i e n t s ,a n dTc e l l s u b s e tm a y b e a p r e d i c t i v e f a c t o r f o r c l i n i c a l o u t c o m e o f H B V ＧP L C p a t i e n t s ．K e y w o r d s :h e p a t i t i sBv i r u s ;㊀p r i m a r y l i v e r c a n c e r ;㊀c e l l u l a r i m m u n i t y ;㊀Tc e l l ;㊀p r e d i c t i v e a n a l y s i s ㊀㊀原发性肝癌(P L C )是全世界最常见第５位癌症,慢性乙型肝炎病毒(H B V )是肝硬化和肝细胞癌的最常见危险因素,在国内所引起的P L C 病例占８０％,此外,国内有７％的人群感染了H B V [１Ｇ２].H B V 相关的P L C (H B V ＧP L C )被认为是一种炎症性癌症.在H B V 感染的情况下,病毒特异性的T８３３ 国际检验医学杂志２０１９年２月第４０卷第３期㊀I n t J L a bM e d ,F e b r u a r y ２０１８,V o l ．４０,N o ．３细胞可能具有保护效应.有研究在H B V感染的黑猩猩以及受H B V感染的患者中敲除H B V特异性C D８＋T细胞可阻滞H B V的清除[３],H B V的控制与具有多功能性的C D４＋T细胞和C D８＋T细胞存在有关.然而在H B V感染长期存在的情况下,患者机体的细胞免疫功能会出现耐受,其中T细胞的功能改变尤为明显[４].我国学者在H B VＧP L C患者中发现其血清中I LＧ１０呈现高表达状态,而且细胞毒性T细胞出现了功能抑制[５],与非H B VＧP L C患者相比,前者血清中调节性T细胞比例出现了显著升高[６],从而导致患者不良临床预后.可以推测T细胞亚群对H B VＧP L C患者的进展及预后有着一定的联系,但是目前鲜有这方面的详尽报道.１㊀资料与方法１．１㊀一般资料㊀本研究为前瞻性研究,选取２０１５年５月至２０１７年６月本院收治的所有原发性肝癌患者１３６例,依据是否存在H B V感染分为H B VＧP L C组(７８例)和非H B VＧP L C组(５８例),其中H B VＧP L C 组中男性患者４２例,女性患者３６例,年龄３１~６８岁平均(５２．５４ʃ１２．２６)岁,H B V的感染经血清学及H B V D N A定量检测后确诊;非H B VＧP L C组中男性患者３４例,女性患者２４例,年龄２９~６５岁,平均(５１．８２ʃ１３．０６)岁,经统计学分析后发现,两组患者在年龄及性别构成总体分布上差异无统计学意义(P＞０．０５),表明两组患者基线水平一致,所有P L C 患者的诊断均经影像学及病理学得到确诊.本次研究经过了医院伦理委员会审查及患者书面知情同意.此外,符合以下情况的病例需排除:(１)血清学证实合并有其他肝炎病毒感染;(２)合并有细菌感染;(３)免疫缺陷的患者;(４)服用了影响免疫系统功能的药物;(５)合并有严重脏器功能不全的患者.１．２㊀方法㊀T细胞亚群及免疫炎性因子检测所有患者血清中C D４＋T细胞㊁C D８＋T细胞和T r e g细胞百分比采用德国B D公司生产的流式细胞仪.免疫炎性因子包括I L(白细胞介素)Ｇ１０㊁I LＧ６㊁I LＧ１β和肿瘤坏死因子Ｇα(T N FＧα),其检测采用酶联免疫吸附试验(E L I S A)法.１．３㊀统计学处理㊀本研究的所有数据处理均采用S P S S１９．０版软件进行.年龄㊁T细胞亚群百分比等计量资料采用xʃs表示,组间比较采用t检验;性别㊁不良预后事件采用构成比表示,组间比较采用χ２检验.采用二分类多因素L o g i s t i c回归分析模型分析T 细胞亚群对H B VＧP L C患者不良预后的影响.P＜０．０５认为差异有统计学意义.２㊀结㊀㊀果２．１㊀两组患者T细胞亚群及免疫炎症因子比较㊀同非H B VＧP L C患者相比,H B VＧP L C患者T细胞亚群出现了显著失调,见表１.如表２所示,H B VＧP L C患者免疫炎症因子也出现了显著失调,其I LＧ１β和T N FＧa表达水平明显高于非H B VＧP L C患者,差异有统计学意义(P＜０．０５),而I LＧ１０水平明显低于非H B VＧP L C患者,差异有统计学意义(P＜０．０５).表１㊀㊀两组患者T细胞亚群比较(xʃs,％)组别n C D４＋T C D８＋T T r e g细胞H B VＧP L C组７８２３．５４ʃ２．５８２６．４７ʃ５．４２９．４８ʃ１．２８非H B VＧP L C组５８１７．３６ʃ３．１９３１．２８ʃ４．５７５．６７ʃ１．０７t１１．２５８８．３２６１３．２４５P０．００１０．０１５＜０．００１表２㊀㊀两组患者免疫炎症因子比较(xʃs,p g/m L)组别n I LＧ１βI LＧ６I LＧ１０T N FＧαH B VＧP L C组７８１６８．４８ʃ２６．４３５８．５２ʃ１５．４３４３．８６ʃ８．７６２３１．１５ʃ２８．２１非H B VＧP L C组５８７８．５６ʃ１１．４８５１．５５ʃ１３．６４１２５．４４ʃ２５．４８１０１．４２ʃ３１．２８t１１．５４８２．３５４１５．９８４１９．６８３P＜０．００１＞０．００１＜０．００１＜０．００１表３㊀㊀不同临床预后的H B VＧP L C患者T细胞㊀㊀㊀亚群比较(xʃs,％)组别n C D４＋T C D８＋T T r e g细胞死亡组３１２５．８７ʃ３．１６２２．５１ʃ３．７７１１．６９ʃ２．２３存活组４７１５．７７ʃ２．３４３４．２６ʃ６．４６４．５１ʃ１．１４t１４．５８７１８．２７４１９．２６２P＜０．００１＜０．００１＜０．００１２．２㊀不同临床预后的H B VＧP L C患者T细胞亚群及免疫炎症因子比较㊀对H B VＧP L C患者进行出院后随访６个月,记录患者死亡事件发生数,并依据是否死亡结局将７８例H B VＧP L C患者分为死亡组(３１例)和存活组(４７例),两组患者在年龄及性别构成比上差异无统计学意义.表３所示,死亡组患者C D４＋T细胞和T r e g细胞百分比明显高于存活组(P＜０．０５),而C D８＋T细胞百分比明显低于存活组(P＜０．０５).而且死亡组患者促炎因子水平也要明显高于存活组(P＜０．０５),而抗炎因子I LＧ１０也要明显低于存活组(P＜０．０５).见表４.２．３㊀T细胞亚群及免疫炎症因子对H B VＧP L C患者９３３国际检验医学杂志２０１９年２月第４０卷第３期㊀I n t J L a bM e d,F e b r u a r y２０１８,V o l．４０,N o．３不良临床结局的影响大小分析㊀由以上结果可知,不同临床结局患者T细胞亚群和免疫炎症因子存在明显差别,意味着这些因素可能对H B VＧP L C患者的临床结局有不同程度的影响,为了明确这些因素影响大小,笔者将这些指标进行了二分类多因素的L o g i s t i c 回归模型分析,其结果如下表５所示.由结果可知,T 细胞亚群(C D４＋T和T r e g细胞)均是H B VＧP L C患者不良临床结局的强风险因素,其O R值分别为３．７６５和２．２３８(P＜０．０５),而C D８＋T细胞可能是一个保护性因子,其O R值为－３．５３７(P＜０．０５),而炎症因子(I LＧ１β㊁I LＧ６㊁I LＧ１０和T N FＧa)对H B VＧP L C患者临床结局的影响均不如T细胞亚群.表４㊀㊀不同临床预后的H B VＧP L C患者免疫炎症因子水平比较(xʃs,p g/m L)组别n I LＧ１βI LＧ６I LＧ１０T N FＧα死亡组３１１３４．２６ʃ３１．４９８４．３６ʃ１６．５１３２．５９ʃ５．８５１９８．５４ʃ４６．８５存活组４７５１．０８ʃ１０．２４３５．２８ʃ６．４７９４．６６ʃ２２．１８４６．８７ʃ１０．０８t１６．５４２１１．２９５１３．１５６１９．６８５P P＜０．００１P＜０．００１P＜０．００１P＜０．００１表５㊀㊀不同H B VＧP L C临床结局患者危险因素L o g i s t i c回归分析结果指标偏回归系数标准误W a l d自由度P O R O R值的９５％C I 下限上限C D４＋T１．４３２０．６７２４．８６６１０．０３６３．７６５１．３０６１９．１９９C D８＋T－１．２６９０．２１７１５．６３４１０．０１０３．５３７１．２７４６．６２９T r e g０．６８２０．２４６７．９１６１０．００３２．２３８１．３４６３．６２６I LＧ１β０．２５４０．１２１２７．５２３１０．０２００．８５６０．８４１０．９２２I LＧ６０．１１９０．２０９１．８８７１０．０８１０．９５１０．５６３１．２９９I LＧ１０－０．３５２０．１１９９．７６４１０．０６２１．４２６１．３３６２．６４０T N FＧα０．６３２０．３２８７．６０６１０．０８３２．２３８１．２４６４．３１６３㊀讨㊀㊀论㊀㊀在中国,原发性肝癌主要是通过慢性H B V感染Ｇ肝硬化发展而来的[７].因而P L C的一个主要风险因素则是H B V的感染,因而在H B VＧP L C和非H B VＧP L C患者中的免疫功能状态是完全不相同的.在H B VＧP L C患者中,存在淋巴细胞百分比增高表明了存在一个比较严重的系统性炎性反应过程.T淋巴细胞对于免疫反应过程是至关重要的.T淋巴细胞包括C D４＋辅助性T细胞(T h细胞)㊁C D８＋T细胞毒性T细胞(C T L细胞)和调节性T细胞(T r e g)等等, T h细胞在增强和推进抗肿瘤免疫反应中起到了重要作用,因为它能够促进B淋巴细胞中抗体的产生增加和C D８＋T细胞向C T L细胞分化的增加[８Ｇ９].C T L 细胞能够识别肿瘤抗原从而直接清除肿瘤细胞,因而扮演了肿瘤细胞 清道夫 的角色而发挥出了抗肿瘤效应[１０].T r e g细胞在抗肿瘤免疫反应应答中主要扮演着负性调控因子的角色,其表达升高会使得P L C 患者临床结局恶化,意味着此时的T r e g细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显减退.T细胞亚群数量的失调出现在许多类型的癌症中,包括非小细胞肺癌㊁头颈部癌和卵巢癌中[１１Ｇ１３].类似的,本研究也显示出了H B VＧP L C患者中出现了T细胞亚群(C D４＋T㊁C D８＋T和T r e g细胞)的数量与非H B VＧP L C患者相比明显不同,这表明了T细胞功能的紊乱和抑制,这就可能与H B VＧP L C患者不良免疫反应有重要关系.同样,２０１４年的研究显示在H B VＧP L C患者中出现了T r e g细胞水平的显著上调,并且与患者H B V D N A 的病毒载荷量呈正相关[６].这些结果表明了T r e g细胞水平与P L C患者的不良预后也具有正相关性,正如本研究所示,死亡组患者T r e g细胞水平要明显高于存活组,意味着降低T r e g细胞水平可能改善患者临床结局.免疫系统中的自然杀伤细胞(N K细胞)能分泌细胞因子(如T N FＧα㊁I LＧ１０)和趋化因子来影响宿主免疫反应,还可以通过穿孔素/颗粒酶或受体相关的信号通路(如F a s㊁肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导性配体)杀灭受病毒感染的细胞[１４Ｇ１５],B淋巴细胞和T淋巴细胞主要分别参与抗体的产生和细胞调控的免疫反应.有研究发现在H B VＧP L C患者中所出现的淋巴细胞(包括N K细胞㊁T和B淋巴细胞)水平的降低反映出了H B VＧP L C患者中抗肿瘤和抗病毒免疫反应的受损情况的发生[１６],而且在H B VＧP L C的病理发生过程中,研究发现胸腺输出功能也出现了受损,这些结果表明了H B VＧP L C患者中T细胞的减少可能至少部分促进了早期胸腺产生的抑制[１６],从而免疫功能出现了抑制.L I U等[１６]的研究表明C D４＋T和０４３ 国际检验医学杂志２０１９年２月第４０卷第３期㊀I n t J L a bM e d,F e b r u a r y２０１８,V o l．４０,N o．３C D８＋T在H B VＧP L C患者中呈现高度活化状态,这种过度激活可引起T淋巴细胞的死亡,这将消耗掉大量的T淋巴细胞并因此减低了H B VＧP L C患者中的C D４＋T和C D８＋T水平,因此在H B VＧP L C患者中T 细胞的减少可能也是部分由于T淋巴细胞的过度活化所致.本研究结果也表明了H B VＧP L C患者和其中的死亡患者中C D８＋T数量要更低,而C D４＋T升高的原因可能是C D８＋T显著下降所引起的相对升高所致.由于H B VＧP L C是一种免疫炎性疾病,患者体内的T N FＧα能够使白细胞活性增加,分泌I LＧ１β的量也随之增加,I LＧ１β反过来又可刺激免疫细胞分泌T N FＧα,使之持续性增加,因而在本研究中笔者发现H B VＧP L C患者中的T N FＧα和I LＧ１β水平要明显高于非H B VＧP L C患者.I LＧ１０能够调控免疫反应进程,其降低意味着免疫反应受到抑制,对于患者机体来说则是非常不利的,其过表达可抑制促炎因子T N FＧα㊁I LＧ６和I LＧ１β的过度释放,因而本研究中H B VＧP L C患者和死亡患者中I LＧ１０要明显低于对照患者.C D４＋T 在抗炎因子I LＧ１０的作用可以分化成T r e g细胞,而C D８＋T则在促炎因子I LＧ１β㊁I LＧ６和T N FＧα的作用下可分化为C T L,因而C D４＋T的增加和C D８＋T的减少意味着H B VＧP L C患者的免疫反应应答减退,患者预后较差.这些结果似乎表明了T细胞亚群和免疫炎性因子可能对H B VＧP L C患者的临床结局都有着重要影响,但是笔者通过进一步L o g i s t i c回归模型分析显示,T细胞亚群(C D４＋T和T r e g细胞)均是H B VＧP L C患者不良临床结局的强风险因素,而C D８＋T细胞可能是一个保护性因子,其降低意味着患者不良结局风险较大,而炎性因子(I LＧ１β㊁I LＧ６㊁I LＧ１０和T N FＧα)对H B VＧP L C患者临床结局的影响均不如T细胞亚群,这表明了T细胞亚群在H B VＧP L C患者临床结局中起到了主导作用.４㊀结㊀㊀论㊀㊀本研究对P L C是否存在H B V感染的情况进行了T细胞亚群变化检测,并探讨了这些亚群变化与患者临床结局的关系,结果表明H B VＧP L C患者中存在显著的T细胞免疫功能失调,T细胞亚群可能成为H B VＧP L C患者临床不良结局的预测因子.参考文献[１]C U IY,J I AJ．U p d a t eo ne p i d e m i o l o g y o f h e p a t i t i sBa n dC i nC h i n a[J]．JG a s t r o e n t e r o lH e p a t o l,２０１３,２８(S u p p l１):７Ｇ１０．[２]Y E O W,MOFK,C HA NSL,e t a l．H e p a t i t i s Bv i r a l l o a d p r e d i c t ss u r v i v a lo f H C C p a t i e n t su n d e r g o i n g s y s t e m i cc h e m o t h e r a p y[J]．H e p a t o l o g y,２００７,４５(６):１３８２Ｇ１３８９．[３]B E R T O L E T T I A,F E R R A R IC．Ad a p t i v ei m m u n i t y i nH B Vi n f e c t i o n[J]．J H e p a t o l,２０１６,６４(１S u p p l):S７１ＧS８３．[４]K A L L A SE,HU I K K,T U R KS,e t a l．Tc e l l d i s t r i b u t i o n i nr e l a t i o nt o H I V/H B V/H C Vc o i n f e c t i o n sa n di n t r a v eＧn o u s d r u g u s e[J]．V i r a l I m m u n o l,２０１６,２９(８):４６４Ｇ４７０．[５]X U E H,L I N F H,T A N H W,e t a l．O v e r r e p r e s e n t a t i o n o f I LＧ１０ＧE x p r e s s i n g B c e l l s s u p p r e s s e s c y t o t o x i cC D４(＋) Tc e l l a c t i v i 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